Chƣơng 2 : MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5.2.Tuyển chọn chủng nấm có hiệu lực ký sinh cao
2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.5.2.Tuyển chọn chủng nấm có hiệu lực ký sinh cao
Tìm các chủng nấm có khả năng ký sinh cơn trùng thơng qua thử trực tiếp đối với sâu cuốn lá cây Dó bầu (Heortia vitessoides Moore, 1885).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Các chủng nấm sau khi phân lập đƣợc cấy trên môi trƣờng PDA thuần khiết. Khi nấm lên bào tử, ta lấy bào tử nấm hòa với nƣớc cất để phun lên sâu. Nuôi sâu trong các hộp nhựa, khi thấy xuất hiện sâu chết ta mang mẫu sâu soi dƣới kính soi nổi, nếu thấy xuất hiện sợi nấm trên cơ thể sâu có thể kết luận đó là chủng nấm ký sinh cơn trùng. Theo dõi lồi sâu bị nhiễm nấm và thời gian gây chết vật chủ của nấm, xác định chủng nấm có hiệu lực mạnh nhất. Sử dụng khóa phân loại để định loại các chủng nấm.[24]
+ Xác định mật độ của các chủng nấm có trong đất
Xác định mật độ của các nấm trong đất bằng phƣơng pháp pha lỗng tới hạn. Tính mật độ nấm/1g đất:
N = ni mi
Trong đó: N là mật độ tế bào hữu hiệu có trong 1 mg đất (CFU/g) ni là số lƣợng khuẩn lạc nấm ở độ pha loãng thứ i mi độ pha loãng
+ Xác định tần suất của các chủng nấm
Tần suất của mỗi chủng nấm ký sinh côn trùng đƣợc xác định thông qua công thức:
Pi% =
Ni Vi
x 100% Trong đó: Pi % là tần suất của chủng nấm thứ i
Vi là số lần xuất hiện của chủng nấm thứ i Ni là tổng số mẫu thí nghiệm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
+ Tính tốn độ đa dạng theo cơng thức tính chỉ số đa dạng của Shannon
H = s i i ix P P 1 ) ln ( H : chỉ số đa dạng
Pi : tần số xuất hiện của loài i S : số loài gặp
2.5.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và sinh thái học của chủng nấm được tuyển chọn
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ đến nảy mầm của bào tử nấm
Bào tử nấm đƣợc lấy thuần khiết đặt trong giọt nƣớc cất vơ trùng trên lam kính, đậy lamen. Các lam kính đƣợc đặt trong tủ định ơn có nhiệt độ 150
C, 200C, 250C, 300C và 350C; mỗi thang nhiệt độ 5 lam kính.
Thu thập số liệu về tỷ lệ nảy mầm và tốc độ nảy mầm của bào tử đƣợc quan sát trên kính hiển vi định kỳ 6 giờ.
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ khơng khí đến nảy mầm và sinh trƣởng của hệ sợi nấm
Chuẩn bị môi trƣờng dinh dƣỡng phù hợp với sự phát triển của hệ sợi; khử trùng và đổ ra các hộp lồng, cấy nấm và nuôi cấy trong điều kiện 150
C, 200C, 250C, 300C và 350C mỗi thang nhiệt độ 8 hộp lồng.
Sau 15 ngày đo đƣờng kính của khuẩn lạc, độ dày hệ sợi ở các công thức thí nghiệm, thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. Tính tốn trị số trung bình làm kết quả thí nghiệm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của ẩm độ khơng khí đến sinh trƣởng và phát triển
của hệ sợi nấm
Tiến hành theo Booth C. Pha NaCl với nồng độ khác nhau trong các bình hút ẩm để tạo ra mơi trƣờng có độ ẩm khơng khí khác nhau, cụ thể nhƣ sau:
NaCl (%) 0 16 32 48 56 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
RH% (250C) 100 90 80 70 60
Chuẩn bị môi trƣờng dinh dƣỡng phù hợp với sự phát triển của hệ sợi; khử trùng và đổ ra các hộp lồng, cấy nấm và nuôi cấy trong điều kiện 250
C, mỗi thang ẩm độ 8 hộp lồng.
Sau 15 ngày đo đƣờng kính của khuẩn lạc, độ dày hệ sợi ở các cơng thức thí nghiệm, thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. Tính tốn trị số trung bình làm kết quả thí nghiệm.
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của pH mơi trƣờng
Chuẩn bị môi trƣờng dinh dƣỡng phù hợp với sự phát triển của hệ sợi; điều chỉnh pH của môi trƣờng bằng HCl 10% và KOH 10% để mơi trƣờng dinh dƣỡng có các trị số pH là 4,0; 5,0; 6,0; 7,0 và 8,0. Khử trùng môi trƣờng và đổ ra các hộp lồng, mỗi độ pH 8 hộp lồng, cấy nấm và nuôi cấy trong điều kiện 250
C. Sau 15 ngày đo đƣờng kính của khuẩn lạc, độ dày hệ sợi ở các cơng thức thí nghiệm, thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. Tính tốn trị số trung bình làm kết quả thí nghiệm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.5.4. Phương pháp đề xuất các giải pháp ứng dụng trong phịng trừ cơn trùng gây hại rừng
Đề xuất các giải pháp ứng dụng nấm ký sinh côn trùng trên cơ sở nghiên cứu về thành phần và mật độ nấm ký sinh có trên mỗi loại đất rừng và đặc điểm sinh học của các chủng nấm trong nuôi cấy thuần khiết; các tài liệu tham khảo.
Trên cơ sở nghiên cứu đặc điểm sinh học bƣớc đầu đề xuất kỹ thuật nhân nuôi sinh khối hệ sợi và bào tử nấm ký sinh côn trùng để sản xuất chế phẩm phục vụ cho cơng tác phịng trừ cơn trùng hại rừng trên địa bàn nghiên cứu.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ PHÂN TÍCH KẾT QUẢ 3.1. Phân lập các lồi nấm có trong đất rừng trồng
Mẫu đất rừng trồng 2 loại Keo: Keo lai, Keo tai tƣợng đƣợc lấy từ các huyện Đồng Hỷ, Phú Lƣơng, Đại Từ, Võ Nhai, Định Hóa, Phú Bình và Thành phố Thái Nguyên và mẫu đất rừng trồng Thông đuôi ngựa đƣợc lấy từ huyện Đồng Hỷ. Mỗi địa điểm lấy mẫu đất tại 3 vị trí: chân, sƣờn, đỉnh; tổng số mẫu đất là 45 mẫu. Các mẫu đất này sau khi chang trên mơi trƣờng PDA (có kháng sinh) 2 ngày, ở nhiệt độ 250C, bắt đầu xuất hiện các khuẩn lạc nấm, sau 10 ngày nhiều khuẩn lạc nấm xuất hiện trên đĩa Peptri. (Hình 3.1).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Sau 10 ngày, dựa vào đặc điểm màu sắc, hình thái đã đếm đƣợc 59 chủng nấm khác nhau xuất hiện trên các đĩa Peptri. Đặc điểm của các chủng nấm đƣợc mô tả trong Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Các chủng nấm phân lập đƣợc từ đất Chủng Chủng
nấm
Mẫu đất Đặc điểm hình thái
K1 PL1C, PL1S, PL1Đ, VN1C, ĐT2Đ, ATK1S, ĐT2S, ATK1C
Trắng, sợi dài, ƣớt.
K2 VN2C, VN2S, VN2Đ Sợi màu nâu tím, mọc lan rộng. K3 PL2C, PL2S, PL2Đ,
ĐHTS, ĐHTC, ĐH2C, ĐH2S, ĐH2Đ
Sợi trắng, khỏe, làm mơi trƣờng chuyển màu tím hồng.
K4 ĐHTS, ĐHTC, PL2C, PL2S, PL2Đ, PB1C, PB1S, PB1Đ, TN1C
Sợi màu hồng nhạt, có nhiều hạt phấn hồng.
K5 PL2C, PL2S, PL2Đ, TN2C, TN2S, ĐT1C, ĐT1Đ
Sợi bông, màu nâu xám, sợi già màu xanh xám.
K6 ĐHTC, ĐHTS, ĐHTĐ Sợi trắng, bông, ở giữa sợi mọc dài, cao. K7 PL1C, PL1S, PL1Đ Màu trắng, sợi dài, thẳng, bông xốp. K8 ĐT2C, ĐT2S, ĐT2Đ, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
TN1C, ATK2C, ATK2S
Trắng ngà, mọc vòng đồng tâm, sợi mịn, làm mơi trƣờng chuyển màu vàng nhạt.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
K9 ĐHTC, ĐHTS, ĐHTĐ Màu trắng, sợi mịn đẹp, mọc hình nón ở giữa.
K10 ĐHTC, ĐHTS, ĐHTĐ Màu trắng, sợi ngắn khỏe, ở giữa màu ghi nhạt.
K11 ĐT2C, ĐT2S, ĐT2Đ, PB2C, PB2Đ
Màu trắng, già màu xám nhạt có phủ nhiều hạt phấn.
K12 ĐT1C, ĐT1S, ĐT1Đ, ĐT2C, TN1C
Sợi vàng, già màu xám rêu, mọc sát mặt thạch.
K13 PL1S, PL2C, ĐT2C, ĐT2C.
Sợi ngắn, mịn, màu trắng, chia múi, ở giữa màu ghi xám.
K14 PL1S, PL1C, PL1Đ, ĐH2C, ĐH2S
Sợi non màu trắng, sợi già màu xám, mọc cao, chia múi, làm môi trƣờng chuyển màu vàng nghệ.
K15 PL1S, PL1Đ, PL1C, TN1C
Màu trắng, sợi già màu xanh rêu, mọc mịn, bám sát mặt thạch.
K16 PL1S, PL1C, TN2C, TN2Đ
Sợi màu xám xanh mọc viền thành lỗ, xung quanh mọc rất bơng, có nhiều bột phấn.
K17 ĐHTĐ, ĐHTS, ĐHTC Sợi non màu trắng, sợi già màu xanh cốm, có bột phấn.
K18 ĐHTĐ, ĐHTS, ĐHTC, ĐH2Đ.
Sợi non màu trắng, sợi già màu ghi xám, chia múi, mọc dày so với mặt thạch.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
K19 PL1C, PL1Đ, PL1S, PL2C, VN1S, ĐHTC.
Màu trắng, sợi mọc bông đẹp, ở giữa mọc lồi dạng nón.
K20 ATK1C, ATK1S, ATK2C Sợi non màu vàng, già màu xám vàng, chia múi.
K21 PB1C, PB1S, PB1Đ Sợi bông xốp, sợi non màu cam, già màu hồng cam.
K22 PL1C, PL1Đ, PL1S, PL2Đ, PL2C, VN1C, VN1Đ
Sợi vàng nhạt, già màu xám rêu, chia nhiều múi nhỏ, trên mặt có sợi bơng, có bột phấn.
K23 ĐHTC, ĐHTS, ĐHTĐ Sợi non màu trắng, sau chuyển màu vàng cam, già màu xanh xám, chia nhiều múi. K24 ĐHTS, ĐHTĐ Sợi non màu trắng, già màu xanh ghi, viền
ngồi mọc bơng dày.
K25 PL1S, PL1C Trắng, sợi mịn, chia múi nhƣng không bám mặt thạch. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
K26 PL1S, PL1Đ, TN2Đ Trắng, già màu xanh ở đỉnh, mọc bông, chia múi nhƣng rãnh nông.
K27 PL1C, PL1S, PL1Đ, ĐT1S
Sợi non màu trắng, mọc bông, già màu xanh, không chia múi, nhiều hạt phấn. K28 PL1C, ĐT2C, ĐT2S Sợi non màu trắng xanh, già màu xanh
rêu, mọc mịn, nhiều bột phấn.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
ĐT1C, ĐT1S xanh rêu, có bột phấn. K30 PL1S, PL1Đ, VN2S,
VN2Đ
Sợi ngắn, màu xanh ghi nhạt, làm môi trƣờng chuyển màu vàng đất.
K31 ĐT2C, ĐT2S, ĐT2Đ Sợi ngắn, sợi non màu trắng, già màu xanh xám rêu, có bột phấn.
K32 PL1C, PL1S, ATK1C, ATK1S
Sợi ngắn, mọc bông, sợi non màu vàng chanh, sợi già màu xanh xám, làm môi trƣờng chuyển màu vàng.
K33 PB2S, PB2C, PB2Đ Sợi dài, mọc bông, màu hồng phấn. K34 PL2S, PL2Đ, PL2C Màu trắng, mọc xốp bông, đáy màu vàng
chanh.
K35 PB1C, PB1S Trắng ghi xám, sợi ngắn khỏe, mọc cao so với mặt thạch, chia múi, làm môi trƣờng chuyển màu vàng.
K36 PL1S, PL1C, TN1C, TN1S
Màu trắng xám nhạt, mọc bông, chia múi nhƣng rãnh nông.
K37 ĐHTĐ, ĐHTS Xốp bông, sợi non màu trắng vàng, già màu xám ghi, trên mặt có nhiều hạt nƣớc. K38 ATK1C, ATK1S,
ATK1Đ, ATK2Đ
Sợi non màu trắng, sau chuyển màu gạch non, sợi già màu xanh ghi, chia nhiều múi nhỏ.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
ATK2Đ, ATK1S, ATK1Đ xanh, phủ hạt phấn.
K40 PB1C, ĐH1C, ĐH1S. Sợi bông, màu trắng xám mốc.
K41 ĐT1C, ĐT1S, ĐT1Đ Màu trắng, sợi dài, mịn, già chuyển màu ngà.
K42 PL2C, PL2Đ, TN2C Sợi trắng, xốp, trong cùng mọc hình nón chóp.
K43 PB1C, PB1S Sợi non trắng bông xốp, sợi già màu vàng chanh, có hạt phấn màu xanh rêu.
K44 PL1C, PL1S, TN1C, TN1S Sợi mảnh, màu vàng ngà. K45 PB1S, PB1C, PB1Đ, PL1S, ĐH1C, ĐH1S Màu trắng, nhìn nhƣ đám bột, mọc dạng u cục. K46 ATK2Đ, ATK2C, PL2S, ATK2S, PL2Đ, PL2C
Sợi màu vàng nhạt, già vàng đậm; mọc sát mặt thạch, chia múi.
K47 ATK1Đ, ATK1S, ATK1C Sợi màu vàng gỉ sắt, mọc sát mặt thạch. K48 ATK2Đ, ATK2S, ATK2C Sợi ngắn, mọc bông xốp, đẹp, màu trắng
sữa. K49 PB2Đ, PB2C, PB2S,
ĐH2C, ĐH2S (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Màu trắng, mọc bông, sợi già màu xám nhạt, chia múi.
K50 PB2Đ, PB2S Sợi ngắn, mọc nhƣ đám bột màu trắng, viền bám rộng mặt thạch.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
K51 ĐH2C, ĐH2S, ĐH2Đ Sợi ngắn, màu trắng, mọc nhƣ đám bột hình vng hoặc trịn mép, chia 4 múi. K52 ĐH2C, ĐH2S, ĐH2Đ Sợi ngắn, màu trắng xám, mọc nhƣ đám
bột sát mặt thạch, viền rộng xung quanh. K53 ATK1C, ATK1S, ATK1Đ Bông xốp, màu trắng già màu đen, sợi dài
thẳng.
K54 ĐHTS, ĐHTC Màu hồng tím, ở giữa già màu xám. K55 PL1C, PL1S, VN1C, VN1S Sợi trắng, viền và giữa màu lông chuột. K56 TN2C, TN2S, TN2Đ Sợi bông xốp, màu mốc lông chuột. K57 PL2Đ, PL2C, PL2S Sợi xanh xám, sợi ngắn, mọc rất chậm,
làm môi trƣờng chuyển màu vàng. K58 PL2Đ, PL2S, PL2C Sợi vàng mỡ gà, hệ sợi chia khe múi. K59 ĐT2C, ĐT2S, ĐT2Đ Sợi trắng bông, sợi già màu xanh xám.
Kết quả phân lập đã cho 59 chủng nấm khác nhau, đa số các chủng nấm này đều là những nấm sinh trƣởng nhanh. Mẫu đất ở Phú Lƣơng có nhiều chủng nấm nhất (cả ở rừng trồng Keo lai và Keo tai tƣợng là 27/59 chủng), mẫu đất tại Võ Nhai có ít chủng nấm xuất hiện nhất (6/59 chủng).
Sự phân bố của các chủng nấm tại các địa điểm lấy mẫu khác nhau có sự khác nhau. Có những chủng nấm xuất hiện ở nhiều địa điểm lấy mẫu đất nhƣ các chủng: K1 (có ở mẫu đất rừng trồng Keo lai tại Phú Lƣơng, Võ Nhai, Định Hóa và đất rừng trồng Keo tai tƣợng tại Đại Từ); K3 (có ở đất rừng trồng Keo tai tƣợng tại Phú Lƣơng, Đồng Hỷ và đất rừng trồng thơng tại Đồng Hỷ); K4 (có ở
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
rừng trồng thông tại Đồng Hỷ, rừng trồng Keo tai tƣợng tại Phú Lƣơng, rừng trồng Keo lai tại Phú Bình và Thái Ngun); K22 (có ở rừng trồng 2 loại Keo tại Phú Lƣơng và rừng trồng Keo lai tại Võ Nhai).
Có những chủng chỉ xuất hiện ở một địa điểm lấy mẫu của một loại rừng trồng nhƣ: các chủng K7, K25 chỉ xuất hiện ở rừng trồng Keo lai tại Phú Lƣơng, các chủng K35, K43 chỉ xuất hiện ở rừng trồng Keo lai tại Phú Bình hay chủng nấm K6, K9, K10, K17, K23, K24, K37, K54, … chỉ xuất hiện ở rừng trồng thông tại Đồng Hỷ.
Ở cùng một địa điểm lấy mẫu đất, các chủng nấm xuất hiện cũng có sự khác nhau. Ví dụ nhƣ mẫu đất lấy tại rừng trồng Keo lai tại Phú Lƣơng, chủng nấm K7 xuất hiện ở cả 3 vị trí: chân, sƣờn, đỉnh nhƣng các chủng K25, K32, K55,… chỉ có ở vị trí sƣờn và chân hay chủng K28 chỉ có ở vị trí chân đồi.
Nhƣ vậy có thể thấy trong đất dƣới tán rừng có rất nhiều các chủng nấm khác nhau, sự phân bố và tính đa dạng của các chủng cũng khác nhau giữa các loại rừng, các loại đất và vị trí lấy mẫu đất trong cùng một địa điểm.
3.2. Kết quả tuyển chọn và đặc điểm phân bố chủng nấm có khả năng ký sinh côn trùng sinh côn trùng
3.2.1. Kết quả tuyển chọn các chủng có hiệu lực cao
Các chủng nấm sau khi phân lập đƣợc cấy truyền trên môi trƣờng PDA thuần khiết và nuôi cấy cho nấm lên bào tử. Sau đó dùng dung dịch chứa bào tử nấm phun lên sâu cuốn lá cây Dó bầu (Heortia vitessoides Moore, 1885). Nuôi sâu trong các hộp nhựa để theo dõi quá trình nhiễm nấm trên sâu (Hình 3.2.).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.2. Thí nghiệm phun bào tử nấm trên sâu cuốn lá cây Dó bầu
Sau khi phun nấm lên sâu 15 ngày, tính số lƣợng sâu bị chết ở các cơng thức thí nghiệm, kết quả các chủng nấm có hiệu lực ký sinh cơn trùng cao đƣợc trình bày ở Bảng 3.2.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.2. Các chủng nấm ký sinh cơn trùng có hiệu lực cao
STT KH chủng Tổng số mẫu đất xuất hiện Tổng số lần xuất hiện
Thời gian từ khi phun đến khi có sâu chết (ngày) 1 K12 5 16 5 2 K15 4 21 4 3 K22 7 29 3 4 K29 5 28 4 5 K39 5 21 5 6 K45 6 21 6 7 K46 6 20 6 8 K49 5 15 8 9 K1 8 25 Khơng có sâu chết 10 K2 3 7 Khơng có sâu chết 11 K3 8 12 Khơng có sâu chết 12 K4 9 21 Khơng có sâu chết 13 K5 7 13 Khơng có sâu chết 14 K6 3 8 Khơng có sâu chết
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 15 K7 3 7 Khơng có sâu chết 16 K8 6 13 Khơng có sâu chết 17 K9 3 11 Khơng có sâu chết 18 K10 3 9 Khơng có sâu chết 19 K11 5 17 Khơng có sâu chết