Chúng tôi tiến hành tinh sạch tổ hợp enzyme protease từ dịch chiết thu đƣợc (sau khi đã loại bỏ bã và lipit) bằng các phƣơng pháp khác nhau nhƣ kết
Ống 1 (ĐC) Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống 5 Ống 6 Ống 7 Ống 8 Vdịch chiết (ml) 0 0.025 0.050 0.075 0.10 0.15 0.20 0.25 Vcazein (ml) 2 2 2 2 2 2 2 2
38
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
tủa enzyme bằng dung dịch muối ammonium sunfate [(NH4)2SO4]; kết tủa bằng cồn 960C; chạy qua máy lọc màng. Từ đó, chọn lựa phƣơng pháp tối ƣu thu nhận đƣợc sản phẩm enzyme có độ tinh sạch cao và hoạt tính mạnh nhất.
2.2.5.1. Tinh sạch tổ hợp enzyme hepatopancreas bằng dung dịch (NH4)2SO4
Phƣơng pháp kết tủa phân đoạn bằng (NH4)2SO4 dựa trên cơ sở sự khác nhau về khả năng kết tủa của các protein enzyme ở một nồng độ muối xác định đƣợc dùng phổ biến để loại bỏ bƣớc đầu protein tạp của các dịch enzyme. Các loại muối có thể đƣợc dùng là (NH4)2SO4, Na2 SO4, MgSO4 ... Ngƣời ta nhận thấy muối (NH4)2SO4 là tốt nhất vì nó không làm hại mà làm ổn định (làm bền) hầu hết các loại enzyme. Loại muối này rẻ và phổ biến. Độ hòa tan của nó lại rất lớn (bão hòa 767g/l ở 250C).
Sản phẩm sau khi kết tủa bằng dung dịch muối (NH4)2SO4 thu đƣợc tổ hợp men thu đƣợc chứa trypsin, Leicinaminopepdiase, protease kiềm, protease trung tính và carboxipeptidase A và B. Trong khi đó, chiết enzyme từ gan tụy đông lạnh của cua biển bằng dung dịch muối kim loại kiềm; tách tủa bằng phƣơng pháp siêu lọc, sản phẩm thu đƣợc gọi là colalitin. Nhƣợc điểm của phƣơng pháp: thời gian dài, hiệu suất thấp, hoạt tính kém. Colagenase gồm 3 thành phần có khối lƣợng phân tử từ 18-27kDa [18].
Chúng tôi tiến hành cân 20g (NH4)2SO4 tinh khiết, hòa tan dần vào 80ml dung dịch enzyme thu đƣợc sau khi ly tâm cho đến khi (NH4)2SO4 tan hết, ta đƣợc dung dịch enzyme chứa 20% (NH4)2SO4. Sau đó, để lạnh 30 phút và ly tâm 8000 vòng/phút. Thu đƣợc dịch trong I và kết tủa I. Cho thêm (NH4)2SO4 vào dịch trong I thu đƣợc ở trên đến nồng độ 30%, để lạnh 30 phút, ly tâm thu đƣợc dịch trong II và kết tủa II. Thêm (NH4)2SO4 vào dịch trong II cho đến nồng độ 40%, để lạnh 30 phút, ly tâm thu đƣợc dịch trong III
39
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
và kết tủa III. Tiến hành tƣơng tự nhƣ trên để thu đƣợc dung dịch enzyme chứa 50%; 60%; 70% và 80% (NH4)2SO4.
Sau khi kết thúc quá trình kết tủa, chúng tôi tiến hành kiểm tra dịch enzyme sau khi đã hòa tan với đệm Tris.Base để lạnh 40C sau đó thử hoạt tính enzyme bằng dunh dịch casein. Sau đó, xác định hoạt tính đặc hiệu và hiệu suất thu hồi (U/mg protein) enzyme protease, xác định protease tách tốt ở giai đoạn nào.
2.2.5.2. Tinh sạch tổ hợp enzyme hepatopancreas bằng phương pháp lọc màng (cross flow membrane)
Việc sử dụng màng siêu lọc cho phép loại bỏ các polyme sinh học không cần thiết với khối lƣợng phân tử lớn hơn 100kDa, bằng cách đó hoạt tính riêng của enzyme cũng đƣợc tăng lên. Dung dịch chứa men hoạt tính sau đó đƣợc sấy đông khô. Trong thành phần chế phẩm tổ hợp men có các protease phân huỷ colagel và các protease phụ thuộc kim loại, các men ribonuclease, deoxiribonuclease, photphodiesterase, photphotase, amilase, lipase và glicolase (protease, nuclease, glicozidase, lipase) [30].
Tiến hành tủa enzyme từ 500ml dịch chiết thu đƣợc bởi cồn 960, nhiệt độ tủa 40
C, thời gian tủa là 1 giờ. Sau đó, ly tâm 8000 vòng/phút trong 15 phút thu enzyme thô. Hòa tan enzyme thô này trong 500ml dung dịch đệm Tris.Base có pH 4.5. Tiến hành lọc 500ml dung dịch enzyme vừa hòa tan trên bằng hệ thống lọc QuixStand Benchtop Systems (hãng Amersham Biosciences) với bộ lọc màng (membrane) có khoảng phân đoạn 10kDa; 50 kDa và 100kDa. Tốc độ bơm mẫu đầu vào lần lƣợt là 150rpm & 200rpm và điều chỉnh sao cho áp suất trên bề mặt màng không quá 5 Psi. Thu dịch qua lọc và xác định hiệu suất thu hồi enzyme và hoạt tính đặc hiệu tƣơng ứng. Dịch chiết đƣợc thử hoạt tính của enzyme protease trên cơ chất là casein.
40
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.2.5.3. Tinh sạch tổ hợp enzyme hepatopancreas bằng cồn theo các tỷ lệ khác nhau
Chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hƣởng của tỉ lệ cồn ở dung dịch sau khi kết tủa bằng cồn ở các nồng độ dung dịch chứa cồn khác nhau để thu nhận tổ hợp enzyme theo các phân đoạn trọng lƣợng phân tử khác nhau.
Tiến hành thí nghiệm: 1kg gan tụy ghẹ đóng đá, xay trong 1.5lít dung dịch đệm Tris.Base. Ly tâm 8000vòng/phút ở 40C trong 20phút loại bỏ bã và màng lipit. Cho cồn 960 vào dịch chiết thu đƣợc dịch chiết chứa 30% cồn 960C, ly tâm qua 8000vòng/phút ở 40C trong 20phút loại bỏ kết tủa thu đƣợc dung dịch M1. Lấy 1 lƣợng nhỏ dung dịch M1 đem thử hoạt tính enzyme với cơ chất là casein. Lấy phần dung dịch còn lại M1 cho thêm cồn 960
sao cho dịch chiết chứa 40% cồn 960C, ly tâm qua 8000vòng/phút ở 40C trong 20phút loại bỏ kết tủa thu đƣợc dung dịch M2. Lấy 1 lƣợng nhỏ dung dịch M2 đem thử hoạt tính enzyme với cơ chất là casein. Lấy phần dung dịch còn lại M2 cho thêm cồn 960 sao cho dịch chiết chứa 50% cồn 960C, ly tâm qua 8000vòng/phút ở 40C trong 20phút loại bỏ kết tủa thu đƣợc dung dịch M3. Lấy 1 lƣợng nhỏ dung dịch M3 đem thử hoạt tính enzyme với cơ chất là casein. Làm tƣơng tự để thu đƣợc dịch chiết M4; M5; M6; M7 tƣơng ứng với tỉ lệ cồn 60, 70, 80 và 90%. Ủ hỗn hợp ở -200C trong 60 phút, ly tâm 8000 vòng/phút trong 15 phút, thu cặn.Phần kết tủa đƣợc hòa tan trở lại dung dịch đệm Tris.Base, sau đó thử hoạt tính của enzyme với cơ chất casein và xác đinh hoạt tính đặc hiệu của enzyme.
2.2.6. Khảo sát ảnh hưởng của dung dịch đệm đến hoạt tính của tổ hợp enzyme hepatopancreas
Để xác định dung dịch đệm thích hợp ở bƣớc đầu tiên khi nghiền nội tạng của cua biển (đƣợc giữ lạnh đông đá), chúng tôi tiến hành nghiền nội
41
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
tạng này với hai dung dịch đệm là dung dịch đệm photphat và dung dịch đệm Tris.Base; cùng tỉ lệ nội tạng thô và thể tích dung dịch đệm nhƣ nhau. Sau đó, ngâm hỗn hợp trong 6 tiếng, rồi tiến hành li tâm 8000vòng/phút ở 40C trong 20 phút lấy phần dung dịch, loại cặn. Dịch chiết đƣợc đem thử hoạt tính với cơ chất casein. So sánh kết quả, chọn đƣợc dung dịch đệm phù hợp cho các thí nghiệm tiếp theo của đề tài.
2.2.7. Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ ly tâm đến khả năng tinh sạch tổ hợp enzyme hepatopancreas
Chúng tôi tiến hành ly tâm dung dịch chứa enzyme sau khi nghiền phần nội tạng cua ghẹ trong dung dịch đệm Tris.Base ở các tốc độ li tâm khác nhau là 2000; 4000; 8000 vòng/phút trong điều kiện 40C để loại bã và lipit. Sau đó, enzyme đƣợc kết tủa theo phân đoạn cồn. Kết tủa đƣợc hòa tan trở lại dung dịch đệm Tris.Base. Sau đó đem thử hoạt tính với casein và xác định hoạt tính đặc hiệu
2.2.8. Khảo sát ảnh hưởng của pH tới hoạt tính tổ hợp enzyme hepatopancreas
Tổ hợp enzyme hepatopancreas cũng nhƣ các enzyme khác đều rất nhạy cảm đối với phản ứng môi trƣờng và mỗi enzyme có vùng pH hoạt động tốt nhất riêng cho mình. Sở dĩ có ảnh hƣởng của độ pH đến hoạt độ của enzyme là vì enzyme có nguồn gốc protein nên khi pH thay đổi sẽ ảnh hƣởng tới độ phân ly các nhóm chức cấu tạo nên trung tâm hoạt động của enzyme nhƣ OH, SH...
Để nghiên cứu ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính của tổ hợp enzyme enzyme hepatopancreas, chúng tôi tiến hành nhƣ sau: Gan tụy cua biển đƣợc nghiền trong dung dịch đệm Tris.Base, ly tâm với các tốc độ 8000 vòng/phút trong điều kiện 40C để loại bã và lipit. Sau đó, enzyme đƣợc kết tủa theo phân
42
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
đoạn cồn. Kết tủa đƣợc hòa tan trở lại dung dịch đệm Tris.Base, chuẩn độ pH ở các giá trị khác nhau (4 đến 9) và xác định hoạt tính phân giải casein. Xác định hiệu suất thu hồi và hoạt tính đặc hiệu của enzyme rồi đƣa ra kết luận pH ở khoảng giá trị nào là tốt nhất.
2.2.9. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính tổ hợp enzyme hepatopancreas
Hoạt động của enzyme lệ thuộc khá rõ vào nhiệt độ của môi trƣờng. Ở nhiệt độ cao enzyme bị tê liệt và phá huỷ do rối loạn về cấu trúc phân tử bậc 2, 3 làm hỏng trung tâm hoạt động đƣợc tạo nên từ các acid quan trọng và nhóm ghép. Nếu tác động của nhiệt chƣa thật sâu sắc thì enzyme có khả năng khôi phục lại cấu trúc và do đó hoạt động xúc tác của enzyme vẫn còn. Nhƣng nhiệt độ quá thấp (gần hoặc dƣới 00C) hoạt động của enzyme yếu dần và hầu nhƣ dừng hẳn lại nhƣng enzyme không bị phá huỷ.
Tiến hành thí nghiệm xác định khoảng nhiệt độ không làm ảnh hƣởng đến hoạt tính của enzyme, chúng tôi cho dịch chiết chứa enzyme sau khi đã loại bỏ cặn và lipid vào tủ nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau (37 – 800C). Sau đó thử hoạt tính enzyme với cơ chất casein.
2.2.10. Điện di protein trên gel polyacrylamide xác định khối lượng tổ hợp enzyme
Gel polyacrylamide, đƣợc tạo thành từ sự polymer hóa acrylamide và sự liên kết chéo của methylenebisacrylamide, đƣợc chọn làm môi trƣờng cho điện di vì nó có tính trơ về mặt hóa học và đƣợc tạo hình nhanh chóng. Điện di là một cách lọc qua gel mà theo đó tất cả các phân tử, không xét về kích thƣớc, sẽ bị tác động một lực để di chuyển trong cùng một chất nền. Gel ở đây có thể xem tƣơng đƣơng với một hạt trong cột lọc gel.
43
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Các protein có thể đƣợc phân tách dựa trên khối lƣợng bằng điện di trên acrylamide dƣới điều kiện đã bị biến tính. Hỗn hợp protein đƣợc hòa tan trong dung dịch sodium dodecyl sulfate (SDS), một chất tẩy mang điện tích âm sẽ phá tất cả các nối không cộng hóa trị của protein ban đầu. Mercaptoethanol (2-thioethanol) hay dithiothreitol cũng có thể đƣợc thêm vào để làm giảm số nối disulfide. Phức hợp SDS với protein đã bị biến tính có một điện tích thực âm tỉ lệ thuận với khối lƣợng của protein. Điện tích âm có đƣợc do gắn với SDS lớn hơn rất nhiều điện tích của bản thân protein ban đầu; vì thế, điện tích ban đầu của protein không ảnh hƣởng đáng kể đến điện tích của phức hợp. Phức hợp SDS-protein sau đó sẽ là mẫu để chạy điện di. Khi điện di kết thúc, những protein trên gel sẽ đƣợc nhìn thấy là một dãy các băng bằng cách nhuộm với bạc hay một chất nhuộm màu nhƣ Coomassie blue. Những đánh dấu phóng xạ có thể đƣợc phát hiện bằng cách đặt một tấm phim chụp X-quang lên miếng gel, quá trình này gọi là phóng xạ tự ghi.
Những protein nhỏ di chuyển nhanh trong gel, trong khi những protein lớn ở phía đầu, gần vị trí nạp mẫu. Tính di động của phần lớn các chuỗi polypeptide dƣới những điều kiện nhƣ thế tỉ lệ với khối lƣợng của chúng. Tuy nhiên, cũng có vài protein giàu carbohydrate và protein màng không tuân theo mối tƣơng quan này. SDS-PAGE có độ phân tách cao, cho kết quả nhanh và độ nhạy cao. Vì vậy, SDS-PAGE giúp chúng ta đánh giá kết quả của quá trình tinh sạch. Với những phân đoạn đầu tiên, kết quả là dãy gồm rất nhiều protein. Nhƣng qua mỗi bƣớc tinh sạch, số lƣợng protein sẽ giảm và sẽ có một băng ngày càng đậm. Vạch đó tƣơng ứng với protein mục tiêu.
Thành phần gel polyacrylamide gồm Tris-HCl, acrylamide, biscrylamide, SDS, EDTA, APS và TEMED. Sau khi chạy điện di, gel đƣợc nhuộm Coomassie Brilliant Blue [0.1% (w/v) Coomassie Blue; 30% (v/v) methanol; 10% (v/v) acid acetic] trong 1 giờ. Sau đó gel đƣợc tẩy màu
44
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
bằng dung dịch tẩy [30% (v/v) methanol; 10% (v/v) acid acetic] cho đến khi bản gel có màu trắng và các băng protein màu xanh xuất hiện.
2.2.5.11. Phương pháp sấy đông khô dịch chiết enzyme
Nguyên tắc của quá trình sấy đông khô: là tách nƣớc ra khỏi nguyên liệu bằng cách chuyển từ trạng thái đá (rắn) vào trạng thái khí mà không qua giai đoạn lỏng (nƣớc). Nhờ vậy, nƣớc đƣợc đƣa ra khỏi nguyên liệu mà không làm hỏng nguyên liệu.
Quá trình sấy đông khô gồm 3 giai đoạn:
+ Giai đoạn 1 – làm lạnh: đây là giai đoạn quan trọng làm lạnh nguyên liệu xuống điểm eutectic - điểm có nhiệt độ thấp nhất mà tại đó pha lỏng và pha rắn cùng tồn tại - đảm bảo cho quá trình thăng hoa xảy ra ở giai đoạn kế tiếp.
+ Giai đoạn 2 – sấy bậc 1: tạo áp suất chân không và hạ nhiệt độ xuống -400 C để nƣớc trong nguyên liệu thăng hoa ở trạng thái lạnh.
+ Giai đoạn 3 – sấy bậc 2: giai đoạn này có nhiệt độ cao hơn giai đoạn sấy bậc 1 để giúp cho nguyên liệu giữ nguyên các tính chất hoá lý. Giai đoạn này áp suất chân không tiếp tục thúc đấy quá trình thăng hoa.
Sau khi sấy đông khô, enzyme thu đƣợc có dạng bột, màu trắng hoặc phớt hồng.
45
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khảo sát mẫu nội tạng cua biển thu nhận từ 2 nguồn thu nhận khác nhau
Thí nghiệm 1: Chúng tôi tiến hành làm thí nghiệm với mẫu nội tạng cua biển thu nhận từ nhà máy chế biến hải sản Nha Trang đƣợc đóng đá, bảo quản trong điều kiện luôn luôn lạnh. Cân 1.2kg gan tụy ghẹ đóng đá, xay trong 1.35lít dung dịch đệm Tris.Base. Ly tâm 6000vòng/phút ở 40C trong 20 phút loại bỏ bã và màng lipit. Dung dịch đƣợc đem thử hoạt tính với cơ chất casein. Kết quả nhƣ sau:
Nhận xét: Kết quả trên cho thấy dịch chiết từ mẫu nội tạng thu nhận từ nhà máy chế biến hải sản có hoạt tính enzyme yếu hoặc quá trình ly tâm chƣa loại bỏ đƣợc hết tạp chất. Quan sát các ống nghiệm đem thử hoạt tính thấy rằng: từ ống nghiệm chứa 0.025 ml đến 0.25 ml dịch chiết đều cho kết tủa trắng. Ống nghiệm chứa 0.25 ml dịch chiết chỉ xuất hiện tủa nhẹ.
Nếu tổ hợp enzyme hepatopancreas trong dịch chiết có hoạt tính cao thì nó sẽ cắt các collagen, phân hủy cơ chất là casein và sẽ không thấy hiện tƣợng kết tủa trong ống nghiệm, dung dịch trong ống nghiệm không có màu (trong suốt). Hiện tƣợng kết tủa ở các ống nghiệm trong thí nghiệm này cho thấy dịch chiết có lẫn tạp chất mà chƣa loại bỏ hết hoặc có hoạt tính yếu.
Mẫu nội tạng cua biển thu nhận từ Nhà máy chế biến hải sản
Vdịch chiết (ml) 0.025 ÷ 0.20 0.25
Vcasein (ml) 2 2
Kết quả Tủa Tủa nhẹ
46
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Thí nghiệm 2: Một phần dịch chiết trong thí nghiệm 1 cho chạy qua màng siêu lọc 50kDa, thu đƣợc hai phần dịch: phần dịch chiết không đi qua màng lọc (>50kDa) và phần dịch chiết đi qua màng lọc (≤50kDa). Sau đó đem thử hoạt tính của hai dịch chiết này với cơ chất là casein thu đƣợc các kết quả sau đây:
Bảng 3.2. Kết quả thử hoạt tính dịch chiết chạy qua màng lọc 50kDa
Nhận xét:
+ Phần dịch chiết không qua màng lọc 50kDa: Các kết quả đem thử hoạt tính của dịch chiết đều cho kết tủa hầu hết các ống nghiệm. Theo những kết quả nghiên cứu khoa học của các nhà khoa học Nga, khối lƣợng phân tử của của tổ hợp enzyme hepatopancreas nằm trong khoảng dƣới 50kDa. Kết quả từ bảng 3.2 cho thấy, dịch chiết vẫn còn lẫn tạp chất và có hoạt tính yếu. Do đó, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm tách chiết bằng các phƣơng pháp khác để thu đƣợc tổ hợp enzyme có hoạt tính cao.