1.1 .Đất canh tác và nhóm chỉ tiêu đánh giá chất lượng đất
1.1.1 .Đất canh tác
1.3.2. Kỹ thuật phân tích DGGE
Trước hết kỹ thuật DGGE được sử dụng trong các nghiên cứu y học và chẩn đoán để xác định các đột biến điểm vào thập niên 80. Sau đó, kỹ thuật DGGE được sử dụng lần đầu tiên để phân tích quần xã vi sinh vật vào những năm đầu của thập kỷ 90 [126]. Theo đó, kỹ thuật này bao gồm những bước cơ bản như sau:
+ Tách chiết ADN/ARN trực tiếp từ mẫu môi trường. ADN là phân tử được
sử dụng thông thường nhất trong các phương pháp dấu vân tay. Bên cạnh ADN, ARN cũng có thể được tách chiết cho mục đích này. Điều này đã dẫn đến một ý tưởng cho rằng các phân tử rARN được tách chiết có thể là một cơng cụ rất tốt cho việc nghiên cứu các lồi vi khuẩn hoạt động tích cực trong các quần xã vi sinh vật bởi sự thật rằng mỗi phân tử ARN đại diện cho một bản sao ribosom và hoạt động của tế bào (tốc độ sinh trưởng) kèm theo một sự tăng số lượng ribosom [152].
+ Khuếch đại các đoạn gen 16S rARN bằng phản ứng PCR. Trình tự của các gen mã hóa cho ARN ribosom (rARN) được quan tâm nhiều nhất trong phân tích các quần xã vi sinh vật. Vùng bảo tồn thích hợp cho việc thiết kế mồi và vùng biến đổi cho phép phân biệt các phân loài vi sinh vật [130]. Trong trường hợp của vi khuẩn, gen 16S rARN là chỉ thị phân tử được sử dụng thường xuyên nhất và các vùng siêu biến đổi V3 (các mồi 341f-GC/518) và V6-V8 (các mồi 968GC-1378) của 16S ribosomal ADN (rADN) được sử dụng phổ biến nhất.
Để ngăn chặn sự biến tính hồn tồn của đoạn ADN trong điện di biến tính DGGE sau này, một kẹp GC- một trình tự giàu GC mà khơng tan chảy- được gắn vào đầu 5’ của các mồi được sử dụng trong PCR [126]. Kẹp này thích hợp cho hầu hết các ứng dụng. Nhờ đó, gần 100% các biến đổi về trình tự có thể được phát hiện [125, 127].
+ Điện di biến tính DGGE. Tiến trình thực hiện DGGE dựa trên sự điện di
các đoạn gen 16S rARN đã được khuếch đại bằng PCR trên một gel poliacrylamit chứa một nồng độ tăng dần của các chất gây biến tính. Sự khác nhau về trình tự của các đoạn ADN khiến cho nhiệt độ tan chảy của chúng khác nhau. Vì vậy các trình tự khác nhau của các đoạn ADN khác nhau sẽ dừng di chuyển tại các vị trí khác nhau trên gel biến thiên nồng độ các chất biến tính và vì vậy có thể được phân tách một cách hiệu quả bởi DGGE [108].
+ Nhân dịng, xác định trình tự gen 16S rARN và định danh. Các nghiên cứu
nghìn lồi vi khuẩn trên một gam đất [150]. Vì vậy sẽ là khơng đáng ngạc nhiên khi các “dấu vân tay” phân tử của các quần xã như thế xuất hiện ở dạng một mẫu hình “dấu vân tay” rất phức tạp. Phân tích DGGE cung cấp một bức tranh (mẫu hình “dấu vân tay”) gồm một dãy các băng có cường độ khác nhau. Cường độ của mỗi băng tương ứng với tần suất của mỗi sản phẩm PCR trong hỗn hợp phản ứng. Một bước nhân dịng trước khi giải trình tự thường được địi hỏi trong các quần xã đặc biệt đa dạng, nơi mà các băng có thể bao gồm một vài trình tự. Mặt khác, DGGE sau đó có thể được cắt ra và tái khuếch đại từng băng (thường là các băng ưu thế) mà có thể được tiếp tục nhân dịng và giải trình tự để định danh các loài ưu thế nhất của quần xã [125]. Hướng tiếp cận này đã được nhận thấy là hiệu quả trong vài trường hợp nhưng chỉ có thể được sử dụng cho một số lượng tương đối hạn chế các băng trên một mẫu.