Chƣơng 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.6. Thực nghiệm
2.6.4. Xác định thành phần vi sinh vật đất bằng kỹ thuật DGGE
Bước 1. Tách chiết ADN tổng số. ADN tổng số của các vi sinh vật có trong
các mẫu đất nghiên cứu được tách bằng PowerSoil®DNA Isolation Kit (MoBio Laboratories, Inc.) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Sau khi tách chiết, ADN được bảo quản ở nhiệt độ -20 đến -80oC nhằm ngăn chặn sự biến tính để sử dụng cho các thí nghiệm PCR và điện di sau này.
Bước 2: Khuếch đại vùng V3 của gen 16S rARN bằng phản ứng PCR. Sau
khi tách chiết ADN tổng số, vùng V3 của gen 16S rARN vi khuẩn (177 bp) được khuếch đại bằng PCR với mồi 341F có gắn thêm trình tự giàu GC (40 bp) tại đầu 5’ và mồi 518R. Trình tự như sau:
341F: 5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3' 518R: 5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'
Những mồi này đặc hiệu cho vi khuẩn và sản phẩm PCR được sử dụng để đánh giá đa dạng tập đoàn vi khuẩn trong các mẫu nghiên cứu. Nhiệt độ gắn mồi trong phản ứng khuếch đại PCR khoảng 65oC.
Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di trên gel agaroza 2% ở 100 V/30 phút, sau đó được nhuộm với Ethidium bromide và quan sát dưới ánh sáng tử ngoại.
Bước 3. Điện di DGGE. Kỹ thuật DGGE được tiến hành thực hiện trên thiết bị
DcodeTM Universal Mutation Detection System (Bio-rad, USA) với kích thước bản gel (16×16) cm. Nồng độ của gel là 10% poliacrylamit với thang biến tính từ 30- 60% urê. Amonipesunphat (APS) được thêm đến nồng độ cuối cùng là 0,09% (w/v) và nồng độ TEMED 0,1% (v/v) trong gel. Gel được để cho polime hóa trong khoảng 60 phút.
Tổng số 20 µl sản phẩm PCR được trộn với thuốc nhuộm và đưa mẫu vào giếng. Mẫu được đặt vào buồng điện di chứa khoảng 7 lít dung dịch đệm 1xTAE và cho chạy hệ thống ở 60oC trong 17,5 giờ, hiệu điện thế sử dụng 130 V.
Sau khi điện di được hoàn thành, tắt nguồn điện của hệ thống và lấy gel ra. Đặt gel vào trong một đĩa đựng 250 ml dung dịch đệm và 25 µl dung dịch ethidium bromit có nồng độ 10 mg/ml. Nhuộm trong 5-15 phút. Sau khi nhuộm, cẩn thận chuyển gel vào trong một đĩa chứa 250 ml đệm nhằm loại bỏ thuốc nhuộm trong 5- 20 phút. Cuối cùng, đặt gel trên một thiết bị UV transilluminator và chụp ảnh.
Bước 4. Phân tích dữ liệu DGGE. Số lượng băng xuất hiện trên bản gel DGGE được phân tích bởi phần mềm QuantityOne-1-D.
Bước 5. Nhân dòng các sản phẩm PCR được tái khuếch đại từ các băng DGGE. Các băng khác nhau trên bản gel DGGE mà được chọn để tiếp tục xác định trình tự nucleotit được cắt ra khỏi bản gel DGGE sau khi nhuộm và được rửa với 50 µl đệm TE và được ủ với 100 µl của 2-mecaptoetanol ở 37oC trong 1 giờ. ADN được kết tủa sau khi thêm 100 µl nước, 20 µl dung dịch NaCl và 550 µl etanol ở nhiệt độ -20oC qua đêm. Các hạt ADN thu được nhờ ly tâm hỗn hợp này trong 20 phút, tốc độ 10.000 vòng/phút ở 4oC; các hạt ADN được rửa bằng etanol 70% và lập lại ly tâm một lần nữa. Các hạt được hồ tan trở lại trong 30 µl đệm TE. Tiến hành tái khuếch đại bằng cách sử dụng 1µl dịch này cho phản ứng PCR. Với mục đích nhân dịng, các sản phẩm PCR được gắn vào một hệ thống vector pGEM-T và được nhân lên trong chủng E.coli JM109 sau quá trình biến nạp.
Bước 6. Xác định trình tự gen 16S rARN để định danh loài vi khuẩn. Các
dịng mang plasmit chứa gen đích được phân lập và sử dụng cho việc xác định trình tự nucleotit 16S rARN của đoạn gen được cắt ra từ các băng trên gel DGGE.