- Huyết thanh ngƣời: Sử dụng bơm kim tiêm vô trùng lấy 35 ml máu
2.3.2. Kỹ thuật hấp phụ miễn dịch liên kết enzym (ELISA) phát hiện IgG Nguyên lý của phản ứng
Nguyên lý của phản ứng
Kháng thể IgG có mặt trong mẫu huyết thanh nhiễm virus kết hợp với kháng nguyên đã đƣợc gắn trên bản nhựa và đƣợc nhận diện khi phức hợp này liên kết với cộng hợp gắn enzyme HRP dƣới tác dụng của chất tạo mầu (cơ chất) và tác nhân oxy hóa (hình 2.6).
Thành phần phản ứng:
TT Thành phần
1 Huyết thanh
Huyết thanh chứng dƣơng, chứng âm và các loại huyết thanh mẫu kiểm tra.
2
Kháng nguyên
Kháng nguyên tái tổ hợp NiV – N- protein (nhóm Henipah)
Kháng nguyên tái tổ hợp N‟- SARS protein Kháng nguyên tái tổ hợp NΔ121 protein (nhóm SARS- Corona)
Kháng nguyên Chikungunya bất hoạt (nhóm Alphavirus)
Kháng nguyên viêm não Nhật Bản bất hoạt (nhóm Flavivus)
Kháng nguyên Banna bất hoạt (nhóm Coltivirus)
3
Cộng hợp
Cộng hợp gắn enzyme horseradish peroxidase (HRP) (kháng thể dê kháng IgG ngƣời gắn enzyme HPR)- American – Qualex, Califonia Cộng hợp gắn enzyme HRP (kháng thể dê kháng IgG dơi gắn enzyme HPR) (Cappel, ICN)
4 Cơ chất H2O2 - ABTS
Chuẩn bị dung dịch phản ứng:
Tên dung dịch Thành phần Thể
tích Dung dich pha loãng (PBS)
NaCl 8g KH2PO4 0.2g Na2HPO4. 2H2O 1.141g KCL 0.2g Sữa tách béo (skim milk) 50g Tổng thế tích H20 1000ml Đệm Carbonate pH 9.6 Na2CO3 0.08g NaHCO3 0.47g Tổng thể tích H20 1000ml
Dung dịch cố định Block ace NaN3 0.02g
Tổng thế tích tích H20 100ml
Chia dung dịch trên ra các chai nhỏ, bảo quản ở 40C.
Chuẩn bị huyết thanh mẫu chứng
Huyết thanh chứng dƣơng Tỷ lệ pha loãng
Mẫu huyết thanh Dơi
Nipah & SARS Pha loãng bậc 2
từ: 1: 1000 - 1: 512.000 Banna, VNNB,
Chikungunya
Mẫu huyết thanh ngƣời Nipah & SARS 1: 400
Mẫu huyết thanh (dơi và ngƣời) đƣợc bất hoạt ở 560C/30 phút.
Qui trình thực hiện phản ứng ELISA:
Tồn bộ q trình phản ứng phải tiến hành trong tủ an toàn sinh học cấp độ 2. Mỗi mẫu huyết thanh trong nghiên cứu hoàn thành thực hiện 3 lần để làm tăng độ chính xác của kết quả. Pha lỗng mẫu thử là huyết thanh dơi theo tỉ lệ 1: 100, mẫu thử là huyết thanh ngƣời: 1: 400.
Các bƣớc tiến hành
Bước 1: Gắn 100 l kháng nguyên với nồng độ 25ng/ giếng trong dung
dịch đệm PBS có 5% skim milk vào phiến nhựa 96 giếng đáy bằng, ủ qua đêm ở 40
Bƣớc 2: Cố định bằng dung dịch Block Ace, ủ 370C/ 60 phút, độ ẩm 5%. Rửa 5 lần bằng dung dịch PBS.
Bƣớc 3: Cho 100 l huyết thanh (chứng dƣơng, chứng âm, mẫu huyết
thanh kiểm tra) đã pha loãng vào phiến (mỗi mẫu đƣợc làm với 2 giếng), ủ 370C/ 60 phút, độ ẩm 5%. Rửa phiến 5 lần bằng dung dịch rửa PBS.
Bƣớc 4: Cho 100 l cộng hợp gắn enzyme HRP pha loãng 1/5000, ủ 370
C/ 60 phút, độ ẩm 5%. Rửa 5 lần bằng dung dịch rửa PBS.
Bƣớc 5: Cho 100 l cơ chất đƣợc pha loãng theo tỉ lệ 1/1: ABTS (2,2‟-
azino-di-(3-ethlybenzthiazoline-6-sulfonate) và hydrogen peroxide vào mỗi giếng, ủ 370C/ 30 phút, độ ẩm 5% trong tối.
Bƣớc 6: Cho 100 l dung dịch 1N H2SO4 để dừng phản ứng vào mỗi
giếng. Đọc kết quả phản ứng bằng máy đọc ELISA tại bƣớc sóng kép 492 nm/620nm.
Nhận định kết quả ELISA phát hiện IgG kháng virus:
Quan sát bằng mắt thƣờng:
Mẫu chứng dƣơng và các mẫu thử có kháng thể IgG kháng virus sẽ có xuất hiện màu vàng.
Mẫu chứng âm, mẫu blank và mẫu thử khơng có kháng thể IgG kháng virus sẽ không xuất hiện nền mầu vàng.
Tính giá trị OD mẫu
Tính giá trị chứng ngƣỡng: Cutoff
= Giá trị trung bình chứng (-) + 3.5 x Độ lệch chuẩn của chứng (-) Mẫu dƣơng tính khi: OD chứng (+)/OD cutoff ≥ 1
Để tránh hiện tƣợng dƣơng tính và âm tính giả, phiến nhựa 96 giếng đã đƣợc chia làm 2 phần: Các giếng từ 1-4 đƣợc phủ kháng nguyên; các hàng cịn lại từ 5-8 khơng sử dụng kháng ngun mà thay vào đó là dung dịch pha loãng.
Sơ đồ thực hiện mẫu xét nghiệm:
Hình 2.7. Sơ đồ mẫu xét nghiệm ELISA trên huyết thanh dơi
Hình 2.8. Sơ đồ mẫu xét nghiệm ELISA trên huyết thanh ngƣời
2.3.3. Kỹ thuật xác định kháng thể trung hòa: kỹ thuật trung hòa gây hủy hoại 50% tế bào (50% CPE Neutralization Test – NT50)