- Huyết thanh ngƣời: Sử dụng bơm kim tiêm vô trùng lấy 35 ml máu
2.3.3. Kỹ thuật xác định kháng thể trung hòa: kỹ thuật trung hòa gây hủy hoại 50% tế bào (50% CPE Neutralization Test – NT 50)
Nguyên lý của phản ứng
Trung hòa là một kỹ thuật nhạy và đặc hiệu để phát hiện kháng thể kháng virus trong mẫu huyết thanh. Nguyên lý của phản ứng: kháng thể có trong mẫu huyết thanh sẽ trung hịa virus do đó khi gây nhiễm hỗn hợp huyết thanh- virus vào dòng tế bào cảm nhiễm sẽ không tạo nên hiện tƣợng CPE (hình 2.9).
Thành phần phản ứng:
TT Thành phần
1 Huyết thanh Huyết thanh thu thập từ dơi, ngƣời 2
Kháng nguyên
Chủng virus Nipah (MA- JMR – 01- 98) DIA 2956. 106,22 TCID50/ml
Chủng virus SARS – Co (Vietnam/NB- 04/2003) DIA-3756. 106,0TCID50/mL Chủng virus Banna phân lập từ muỗi ở Hà Tây, Việt Nam
Chủng virus Chikungunya gốc (S-27). 106,0TCID50/mL
Chủng virus VNNB
3 Tế bào
Tế bào BHK – 21, NIKEN, Nhật Bản Tế bào Vero E6, NIID Nhật Bản
Tế bào muỗi Ae.albopictus dòng C6/36 4
Môi trƣờng
Môi trƣờng nuôi cấy MEM 10% FCS Môi trƣờng duy tri MEM 2% FCS
5 PBS 0,01M PBS, pH 7,2
Các bƣớc tiến hành
Bƣớc chuẩn bị tế bào: sử dụng một trong các dòng tế bào sau tùy thuộc loại virus thực hiện: Vero E6, tế bào BHK -21, C6/36.
- Kiểm tra chai tế bào 1 lớp (90-95% diện tích bề mặt chai nuôi cấy). Thông thƣờng 1 chai ni tế bào có diện tích 162cm2
sẽ tách đƣợc 7-10 phiến nhựa 96 giếng.
- Rửa tế bào bằng dung dịch rửa PBS, sau đó thêm 3-4ml trypsin, ủ 370C cho đến khi tế bào tách rời nhau. Thêm 5-10ml môi trƣờng để trung hòa trypsin, ly tâm 1500 vòng/5 phút, hòa cặn tế bào trong môi trƣờng phát triển, đếm tế bào bằng buồng đếm.
- Pha tế bào ở nồng độ 1,5x104 tế bào/ml bằng môi trƣờng phát triển, nhỏ 100ul dung dịch tế bào vào mỗi giếng của phiến 96 giếng, ủ 370C, 5% CO2 trong 2 ngày.
1. Chuẩn bị huyết thanh: bất hoạt huyết thanh ở nhiệt độ 56oC trong 30 phút, pha loãng huyết thanh bậc 2 bắt đầu từ 1:10 trên phiến nhựa 96 giếng.
* Những bƣớc sau thực hiện trong phịng thí nghiệm an tồn cấp độ 3
2. Pha kháng nguyên virus gốc từ 106.0
TCID50/mL thành 200TCID50/0,1mL bằng mơi trƣờng duy trì MEM chứa 2% FCS (ví dụ: kháng nguyên virus ban đầu là 106.0
TCID50/mL, pha loãng 500 lần để đƣợc nồng độ 200TCID50/0,1mL).
3. Trộn thể tích bằng nhau (200uL) của kháng nguyên virus pha loãng (200TCID50/0,1mL) và các mẫu huyết thanh ở các độ pha lỗng khác nhau (200uL), ủ ở 37oC có 5% CO2 trong 1 giờ.
4. Pha loãng bậc 10 kháng nguyên ở nồng độ 200TCID50/0,1mL để chuẩn độ ngƣợc kháng nguyên.
5. Loại bỏ môi trƣờng phát triển của phiến nhựa 96 giếng có chứa tế bào 1 lớp bằng pipet đa kênh. Nhỏ 100ul hỗn hợp ủ của kháng nguyên virus và huyết thanh vào 3 giếng tại mỗi nồng độ pha loãng. Ủ 4-5 ngày ở 37oC, 5% CO2.
6. Quan sát các giếng có CPE (+) và CPE (-) dƣới kính hiển vi lộn ngƣợc. 7. Xác định giá trị NT50 (áp dụng công thức của Reed – Muench) và kiểm tra kết quả chuẩn độ lại kháng nguyên virus để xác định nồng độ đƣợc dùng trong phản ứng là 200TCIID50/0,1mL.
Sơ đồ hóa các bƣớc thực hiện NT50 Xử lý và pha loãng huyết thanh
Huyết thanh đƣợc bất hoạt ở 560C, 30 phút.
Chuẩn bị kháng nguyên
Pha loãng virus gốc từ 106.0
TCID50/mL thành 200TCID50/0,1mL bằng môi trƣờng MEM 2% FCS.
Trung hịa kháng ngun+ huyết thanh
Độ pha lỗng huyết thanh 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 Huyết thanh (uL) 40 200 200 200 200 200 200 200 200 Môi trƣờng 2% FCS 360 200 200 200 200 200 200 200
+
200TCID50/0.1mL virus (uL) 200 200 200 200 200 200 200 200 Tổng số (uL) 400 400 400 400 400 400 400 400
Chuẩn độ ngƣợc kháng nguyên
Độ pha loãng gốc 10-1
10-2 10-3 10-4
200 TCID50/0,1mL virus (uL) 500 50 50 50 50
MEM 2%FCS (uL) --- 450 450 450 450
Sơ đồ phiến tra mẫu trên phiến nhựa 96 giếng A B C D E F G H 1 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 2 3 4 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 5 6 7 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 8 9 10 Chuẩn độ ngƣợc 10x 100x 1000x 10000x Chứng tế bào Chứng tế bào Chứng tế bào 11 12 Nhận định kết quả Điều kiện phản ứng đƣợc chấp nhận
Tế bào chứng: Tế bào phải tạo một lớp bình thƣờng khi quan sát dƣới kính hiển vi lộn ngƣợc.
Nhận định kết quả
Tất cả các mẫu huyết thanh có giá trị NT50 ≥ 10 đƣợc xác định là dƣơng tính.