Bảng 1 .1 Một số dạng As trong các đối tƣợng sinh học và môi trƣờng
Bảng 1.3 Dụng cụ chứa dung dịch mẫu và điều kiện bảo quản
TT Chất phân tích Dụng cụ P=Chất dẻo (PE,PTFE,PVC,PET) G=Thuỷtinh BG=Thuỷ tinh Bosilicat
Điều kiện bảo quản
Thời gian bảo quản tối đa Tiêu chuẩn quốc tế
1 As, Hg P hoặc G Axit hóa đến pH<2 1 tháng ISO 6595
[50]
2 Cr(VI) P hoặc BG Làm lạnh từ 50C đến 20C 24h
3 Các kim loại
nặng (trừ Hg) P hoặc G Axit hóa đến pH<2 1 tháng ISO 8288
4 Sunfua P hoặc G
Nếu cần, kiềm hoá ngay mẫu bằng natricacbonat. Nạp mẫu đầy bình để đuổi hết khơng khí
24h
5 Sunfit P hoặc G
Cố định tại chỗ bằng cách thêm 1 ml EDTA 2,5% cho mỗi 100ml mẫu
48h
6 Fe(II) P hoặc G Axít hố bằng HCl đến pH<2 và
đuổi oxi khơng khí 12h
7 Thủy ngân
tổng số BG
Axit hoá đến pH<2 bằng HNO3 và thêm K2Cr2O7 đến nồng độ cuối
cùng 5% 1 tháng
ISO 5666
8 Nitrit NO2- P hoặc G Làm lạnh từ 50C đến 20
C 24h ISO 6777
9 Nitrat NO3- P hoặc BG Axit hoá đến pH<2 hoặc làm lạnh
từ 50C đến 20C 24h ISO 7890 10 Photphat tổng số P hoặc G Làm lạnh từ 50C đến 20 C 24h ISO 6878 11 Photphat hòa tan P hoặc G
Lọc mẫu ngay tại chỗ, làm lạnh từ 50C đến 20
C 24h ISO 6878
Theo nhƣ nghiên cứu của các tác giả Blaine [27] cho thấy, vật liệu chứa mẫu làm bằng thủy tinh thƣờng hấp phụ các anion do đặc tính của lớp silic oxit trên bề mặt thủy tinh thƣờng bị thủy phân tạo lên một lớp hấp phụ pha rắn mang điện tích dƣơng. Một nghiên cứu khác [36] lại chỉ ra rằng các vật liệu bằng nhựa PE, PTE, PP, Teflon không hấp phụ các dạng hợp chất Se vơ cơ tan trong nƣớc nhƣng lại có ái lực với các hợp chất hữu cơ không phân cực của Se nhƣ DMDSe. Trong nghiên cứu xác định hàm lƣợng các dạng As trong mẫu máu và nƣớc tiểu [44], các tác giả cũng chỉ rõ nếu chứa mẫu bằng vật liệu thủy tinh thì sau 8h hàm lƣợng As tổng số giảm đi 38%.
Trong nghiên cứu về sự chuyển hóa các dạng As, tác giả X.C Le [62] và cộng sự đã mô tả rằng trong mẫu nƣớc As(V) là một dạng chiếm ƣu thế, dạng As(III) và As(V) có sự chuyển đổi qua lại với nhau một cách rõ nét phụ thuộc vào nền mẫu,
As(III) bị chuyển hóa thành As(V), nhƣng trong một vài trƣờng hợp As(V) lại bị khử về As(III). Tác giả cũng đƣa ra khuyến cáo là cần thêm chất ổn định loại trừ ảnh hƣởng của nền mẫu nhƣ EDTA vào dung dịch mẫu trƣớc khi đem bảo quản.
Một nghiên cứu khác, tác giả A.C Schmidt [79] đƣa ra báo cáo rằng trong quá trình bảo quản mẫu nƣớc thải phân tích dạng As, dạng MMA và DMA khơng thay đổi trong nhiều tháng, nhƣng As(III) lại chuyển hóa thành As(V) ngay ở 40C và sự ổn định của As(III) phụ thuộc vào nền mẫu. Tác giả đã khảo sát sự ổn định của As(III) trong mẫu nƣớc thải thô và thấy rằng xung quanh giá trị pH = 7 sự ổn định cao hơn là ở giá trị pH gần tới 1. Kết quả khảo sát với ảnh hƣởng của nhiệt độ lại cho thấy sự chuyển hóa As(III) thành As(V) tăng khi nhiệt độ tăng, cụ thể 100% As(III) chuyển hóa thành As(V) trong 120h khi bảo quản ở nhiệt độ trên 210C, nhƣng nếu bảo quản ở nhiệt độ 100
– 200C thì chỉ có 5% As(III) biến đổi.
Việc có mặt của các chất có tính oxi hóa nhƣ oxi hòa tan, cromat CrO42-, MnO4-, ion Fe3+, Ag+…trong mẫu cũng làm các dạng biến đổi đáng kể [61]. Theo nhƣ cơng trình nghiên cứu của tác giả Aggett [53], với thời gian lƣu mẫu nƣớc có chứa lƣợng oxi hịa tan bão hòa là 10 giờ thì hàm lƣợng As(III) tìm thấy chỉ cịn 68% so với lúc ban đầu và lƣợng As(V) tìm thấy lại tăng lên 33%. Để loại trừ ảnh hƣởng của sự chuyển dạng của Se(VI) thành Se(IV), các tác giả M. Willians [36] đã thêm L-Cystein 0,2%/HCl 0,01M vào dịch chiết mẫu đất bằng axit citric 100mM, tiếp theo tác giả sục nitơ khoảng 20 phút trƣớc khi bảo quản trong tủ lạnh ở 40C. Kết quả cho thấy hàm lƣợng Se(IV) và Se(VI) thay đổi khoảng ±5%, ±12% cho mỗi dạng sau một tuần lƣu mẫu.
Đã có nhiều phƣơng pháp đƣợc sử dụng để bảo toàn những dạng As phân bố trong mẫu tự nhiên. Những mẫu chứa hàm lƣợng As(III) và As(V) có nồng độ 0,5mg/l hoặc 1mg/l đƣợc bảo quản tại 40C ổn định đƣợc 21 ngày. Tại 50C nhận xét thấy có những dung dịch có hàm lƣợng Asen cao nhất (<20mg/l) vẫn có thể bảo quản mà khơng có sự mất mát đáng kể của các dạng As [52]. Tuy nhiên, ở tại nồng độ thấp hơn, tác giả quan sát thấy sự biến đổi của các dạng vào cuối tuần đầu tiên. Một số nghiên cứu cho thấy rằng bảo quản mẫu tại -200C là tốt nhất để giữ các dạng
[12]. Những phƣơng pháp bảo quản trên cho các dạng ban đầu của As(III) và As(V) phải thực hiện ngay lập tức sau khi thu thập mẫu thì mới có hiệu quả, nhất là khi mẫu đƣợc sử dụng để phân tích hải sản- một trong những loại mẫu rất dễ bị phân hủy dẫn đến làm sai lệch kết quả phân tích.
1.4.2. Các kỹ thuật tách chiết mẫu trong phân tích dạng
Đối với phƣơng pháp chiết, cần phải xem xét xem liệu phƣơng pháp chiết đó có thể sản sinh ra bất kỳ sự biến đổi nào của những dạng hiện có trong mẫu cần xác định hay khơng. Nhìn chung, nếu lấy mẫu ở cùng một địa điểm thì quá trình chiết As, Se từ những mẫu rắn là hầu nhƣ không khác nhau khi mẫu đƣợc bảo quản tốt. Chuẩn bị mẫu cho những mẫu rắn nói chung có thể bao gồm những q trình nhƣ: xắt nhỏ, đơng khơ, nghiền, trộn đều và rây để dùng cho quá trình chiết. Một phép chiết đạt yêu cầu cần phải chiết hoàn toàn tất cả các dạng As, Se mà không làm thay đổi dạng ban đầu của nó. Đồng thời, dung mơi để chiết các mẫu khơng đƣợc gây trở ngại cho sự phân tích dạng. Việc sử dụng dung mơi chiết và phƣơng pháp chiết sẽ quyết định sự chiết hồn tồn hay khơng, q trình chiết đạt hiệu suất cao nhất là lấy đƣợc nhiều dạng ra khỏi mẫu. Tuy nhiên, sự chiết cũng phụ thuộc vào loại mẫu, loại dạng chất có thể chiết ra đƣợc hay khơng.
Với mẫu thực vật, các dung môi thƣờng đƣợc dùng để chiết các dạng As là metanol, nƣớc, axit HNO3, axit fomic, đệm phốt phát, nhƣng tốt hơn cả là sự pha trộn các dung môi với nhau [35, 85] . Quá trình chiết có thể hồn thành trên các máy rung lắc và làm nóng, trợ giúp của sóng siêu âm, chiết lỏng cao áp hoặc vi sóng và thậm chí là sự kết hợp của các loại công cụ trên. Các dạng của nguyên tố Se cũng có thể áp dụng hồn tồn các phƣơng pháp chiết tƣơng tự.
Với mẫu bùn đất, dung dịch phổ biến đƣợc sử dụng để chiết các dạng As(III), As(V) vô cơ là axit H3PO4 lỗng, q trình chiết thƣờng đƣợc trợ giúp nhờ máy rung lắc hoặc máy rung siêu âm [34, 54]. Cơ chế chiết với mẫu bùn đất thƣờng là hịa tan các muối vơ cơ vào trong dung dịch, phản ứng trao đổi ion giữa các muối, quá trình này thƣờng kéo dài hơn so với quá trình chiết trong mẫu thực vật. Để
tránh sự chuyển dạng trong quá trình chiết dạng, dung dịch EDTA thƣờng đƣợc cho vào cùng với dung môi chiết [69].
Dƣới đây là một số phƣơng pháp chiết đã đƣợc áp dụng trong phân tích dạng As, Se:
- Phƣơng pháp hòa tan (solubilization) với HCl và làm bay hơi bằng lị vi sóng:
Cơ sở của phƣơng pháp hòa tan với HCl và làm bay hơi bằng lị vi sóng đƣợc trình bày thành phƣơng pháp chiết As vơ cơ từ những sản phẩm hải sản [12]. Tuy nhiên, phƣơng pháp này khơng thích hợp để xác định những dạng As(III) và As(V) vì As(V) đƣợc chuyển đổi sang As(III) trong suốt quá trình thủy phân và chiết. Sự chuyển đổi giữa As(III) và As(V) cũng đƣợc thấy khi sử dụng axit tricloroacetic để thủy phân những mẫu gạo [42]. Mới đây, phƣơng pháp có khả năng chiết nhanh (Accelerated Solvent Extraction - ASE) đƣợc áp dụng để chiết những dạng As trong mẫu rắn [42, 57]. Phƣơng pháp bán tự động này sử dụng áp suất và nhiệt độ trong suốt thời gian chiết, cho thấy nó nhanh hơn và ít mất cơng sức hơn so với phƣơng pháp chiết truyền thống. Tuy nhiên, so sánh với phƣơng pháp chiết rung siêu âm với hỗn hợp metanol- nƣớc (1:1) thì khả năng thu hồi As trong mẫu thấp hơn 10-20% [47].
Những quá trình chiết khác nhƣ chiết Soxhlet [12] và chiết pha rắn cũng đƣợc áp dụng. Metanol là dung môi thƣờng đƣợc sử dụng nhất để chiết những dạng As từ những mô sinh vật. Sự bay hơi của metanol và phân chia phần cịn lại giữa đietyl eter/nuớc có thể cung cấp thơng tin về những số lƣợng tƣơng đối của As hòa tan trong lipid và hòa tan trong nƣớc. Ngồi ra ngƣời ta có thể dùng hỗn hợp metanol/cloroform/nƣớc để chiết As trong mô sinh vật nguyên bản. Cả hai quy trình thu hồi phần lớn As trong giai đoạn chiết.
- Phƣơng pháp chiết sử dụng dung mơi hịa tan kết hợp rung siêu âm:
Hiện nay phƣơng pháp chiết dùng hỗn hợp metanol: nƣớc và kết hợp rung siêu âm nhiều lần đuợc sử dụng rộng rãi nhất vì đây là một phƣơng pháp chiết rất tốt thể hiện qua hiệu suất thu hồi các dạng As hòa tan trong mẫu rắn lên tới 95% [12].
Nguyên tắc chung của quá trình chiết siêu âm là dựa trên sự phân bố của chất vào hai pha không trộn lẫn vào nhau nhờ có thêm tác dụng của năng lƣợng sóng siêu âm (năng lƣợng tia vi sóng). Pha chứa mẫu phân tích cần thiết là pha nƣớc và
pha lỏng để chiết chất phân tích là dung mơi hữu cơ (pha thứ hai) đều đƣợc cho vào bình chiết, sau đó đƣợc đặt vào trong hộp chiết của hệ chiết vi sóng và tiến hành chiết dƣới tác dụng của sóng siêu âm thích hợp trong thời gian nhất định (1,5 – 2 giờ). Cách này có thể đƣợc thực hiện ở hai trạng thái mẫu đồng thể và dị thể. Khi chiết, dƣới tác dụng của năng lƣợng sóng siêu âm có tần số cao, mạng cấu trúc của các phân tử chất mẫu bị phá vỡ, chất phân tích đƣợc giải phóng và phân bố (hay tan) vào trong dung mơi chiết theo tính chất của nó ở dạng phân tử hay dạng phức chất. Hệ số phân bố (Kpb) của chất giữa hai pha không trộn lẫn vào nhau cũng là yếu tố quyết định hiệu quả chiết. Còn năng lƣợng siêu âm có tác dụng chính là phá vỡ cấu trúc ban đầu của mẫu, xáo trộn hỗn hợp chiết, tạo điều kiện tốt cho cân bằng chiết xảy ra dễ dàng, nhanh hơn và triệt để hơn.
Năng lƣợng siêu âm cũng có vai trị lớn quyết định hiệu suất chiết, theo cơng trình của tác giả Chatterjee A [32] cho thấy ở công suất 450W với 15 phút rung siêu âm có 74% asenic đƣợc trích ly, ở cơng suất 300W có 68% asenic đƣợc trích ly và ở cơng suất 100W có 63% đƣợc trích ly.
Ở Việt Nam, theo phƣơng pháp chiết siêu âm có thể kể cơng trình của tác giả Chu Đình Bính và cộng sự [4] đã sử dụng hỗn hợp MeOH:H2O theo tỉ lệ 9:1 tƣơng ứng để chiết các dạng As(III), As(V), DMA, MMA từ mẫu động vật thủy sinh (trai, ngao, sò huyết…), hỗn hợp đƣợc rung siêu âm khoảng 30 phút rồi ly tâm 10 phút với tốc độ 3000 vòng/phút. Dịch trong thu đƣợc sau 3 lần chiết đƣợc gom lại và cơ đuổi dung mơi ở 500C trong khí quyển nitơ và xác định các dạng As bằng phƣơng pháp HPLC – AAS. Đối với mẫu đất, các tác giả đã dùng axit H3PO4 100mM có chứa NH2OH/HCl 0,1% để chiết các dạng As trong 6 giờ trên máy lắc, độ thu hồi của quá trình chiết đạt tới 95,3%. Trong một thí nghiệm khác, dung môi MeOH:H2O = 5:5 đƣợc tác giả dùng để chiết các dạng As(III), As(V), DMA ra khỏi mẫu rong biển với phƣơng pháp rung siêu âm, thời gian xử lý cho mỗi lần chiết là 30 phút, quá trình chiết lặp 3 lần cho độ thu hồi là 98%.
Ngoài ra tác giả Lê Thị Duyên [1,6] khi tiến hành xác định các dạng Se(IV), Se(VI), DMDSe, SeMet trong các mẫu hải sản bằng phƣơng pháp điện hóa đã đƣa
ra một quy trình xử lý mẫu nhƣ sau: trƣớc hết mẫu đƣợc đông khô và nghiền nhỏ, sau đó mẫu đƣợc xử lý với dung dịch HCl 0,2M, rung siêu âm và lọc lấy phần trong. Dịch trong đƣợc thêm CH2Cl2 tách thành hai pha, pha nƣớc đƣợc sử dụng xác định các dạng Se vô cơ, pha hữu cơ đƣợc xử dụng để xác định các dạng Se hữu cơ. Quá trình xử lý mẫu đạt đƣợc độ thu hồi là 95%.
Một chú ý trong quá trình xử lý mẫu đó là hàm lƣợng các dạng khác hoặc các dạng cần xác định còn lại trong mẫu sẽ phản ánh hiệu suất của quá trình chiết. As và Se cịn lại sau khi chiết bằng metanol có thể còn trong bã, hoặc phản ánh sự chiết khơng hồn tồn vài dạng As, Se phân cực hơn. Ví dụ, khi phân tích HPLC/ICP-MS dịch chiết metanol mẫu đơng khơ gan rùa cho thấy Asenat là vết, nhƣng chiết bằng nƣớc liên tục của cùng chất đó thì hàm lƣợng Asenat chiếm 35% tồn bộ As có thể chiết ra [40]. Một vài As hữu cơ (ví dụ Asenosugar) rất phân cực, nếu chiết bằng metanol thì chỉ tìm thấy hàm lƣợng thấp trong mẫu sinh vật, nhƣng khi chiết bằng dung dịch HCl 0,5M lại xác định hàm lƣợng đáng kể.
Quá trình xử lý mẫu sơ bộ cũng ảnh hƣởng đến sự chiết các dạng nguyên tố phân tích ra khỏi mẫu, ví dụ nếu chiết mẫu cây thân thảo sau khi đơng khơ hoặc sấy khơ thì dạng Asen phytochetalin (As-PC) lại khơng có nhƣng khi chiết tƣơi lại thấy sự tồn tại của dạng này [27, 94]. Một nghiên cứu của tác giả Schmidt [79] với mẫu thực vật thân thảo ở dạng mẫu tƣơi và sấy khơ cho thấy đều tìm thấy dạng MMA, DMA, As(V), As(III).
Qua phân tích trên có thể thấy đối với các mẫu thực vật các dạng As(III), As(V), MMA, DMA thƣờng đƣợc chiết bằng hỗn hợp metanol – nƣớc; với mẫu bùn đất, các dạng này thƣờng đƣợc chiết bằng dung dịch đệm phốt phát hoặc axit H3PO4. Quá trình chiết đƣợc thực hiện trên máy rung siêu âm, vi sóng hoặc máy lắc để tăng khả năng chiết hoàn toàn và giảm thời gian chiết. Sự chiết các dạng Se(IV), Se(VI), DMDSe, SeMet cũng hoàn toàn tƣơng tự nhƣ đối với các dạng As do các dạng này cũng hòa tan đƣợc trong nƣớc và metanol.
Qua những luận điểm đã phân tích ở trên, có thể thấy phân tích dạng nguyên tố là một nhu cầu tất yếu trong các nghiên cứu về môi trƣờng. Trong khi ở Việt
Nam số phịng thí nghiệm đƣợc trang bị các thiết bị ghép nối rất ít, các phép phân tích dạng chủ yếu vẫn là sử dụng kỹ thuật tách trƣớc rồi phân tích và phân tích một vài dạng cụ thể. Các phép phân tích nhiều dạng, đặc biệt là phân tích đồng thời nhiều dạng cùng lúc chƣa đƣợc phát triển mạnh trong khi các thiết bị phân tích hiện đại nhƣ máy đo phổ AAS, ICP – MS, HPLC, thậm chí là ICP – MS/MS…lại đƣợc trang bị rất phổ biến. Chính vì vậy cần phải có một phƣơng pháp phân tích vừa tận dụng đƣợc các thiết bị phân tích đã có vừa giải quyết đƣợc bài tốn phân tích đồng thời nhiều dạng cùng lúc và khắc phục đƣợc hạn chế của phƣơng pháp tách riêng từng dạng rồi phân tích. Trong bối cảnh đó, việc nghiên cứu ứng dụng chemometrics trong phân tích dạng là một hƣớng đi mới phù hợp với thực tế.
CHƢƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Hóa chất và thiết bị 2.1. Hóa chất và thiết bị
2.1.1. Thiết bị, dụng cụ
- Tất cả các dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh đều là dụng cụ có độ chính xác cao. Các dụng cụ đƣợc rung siêu âm, rửa sạch bằng nƣớc cất 2 lần đã đề ion hóa trƣớc khi tiến hành mỗi thí nghiệm. Các thí nghiệm đều tiến hành ở khoảng 250
C nhờ hệ thống máy điều hịa khơng khí, thời gian để ổn định nhiệt khoảng 30 phút.
- Cốc teflon, cuvet thạch anh cho bộ HVG, cuvet thạch anh cho quá trình phân hủy mẫu.
- Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) Model AA-6800 ghép nối hệ thống HG, hãng Shimazhu, Nhật Bản.
- Cân phân tích và cân kỹ thuật có độ chính xác 10-4g. - Máy đo pH HANNA Instrument 2.11
- Micro Pipet các loại 20, 50, 100, 150, 500, 1000 µl của hãng Bomex (Đức).