Dạng As As(III) As(V) DMA MMA
Hàm lƣợng thêm chuẩn (ppb) 3,0 8,0 3,5 3,5
Hàm lƣợng có trong mẫu (ppb) 4,3 ± 0,2 9,2 ± 0,1 <LOD 4,8 ± 0,2 Hàm lƣợng sau thêm (ppb) 7,4 ± 0,1 17,8 ± 0,2 3,5 ± 0,2 8,0 ± 0,1 Hàm lƣợng thu đƣợc (ppb) 3,1 ± 0,3 8,6 ± 0,3 3,5 ± 0,2 3,2 ± 0,3
Độ thu hồi (%) 103,4 ± 10 106,9 ± 4 100,0 ± 6 91,7 ± 9
Qua kết quả ở các bảng 3.25 cho thấy độ thu hồi các dạng khi xác định bằng phƣơng pháp HG – AAS – PCR đều khá cao (>80%). Mặc dù hàm lƣợng dạng DMA trong mẫu có giá trị rất thấp (<LOD), nhƣng khi phân tích mẫu thêm chuẩn lại có giá trị xấp xỉ lƣợng thêm vào. Độ lệch chuẩn của hàm lƣợng các dạng thêm vào mẫu nƣớc ngầm đều nhỏ. Có thể kết luận phƣơng pháp HG - AAS - PCR cho độ thu hồi tƣơng đối tốt, hồn tồn áp dụng tốt vào phân tích mẫu thực tế.
3.3.5. Độ chụm và độ đúng của phƣơng pháp HG – AAS - PCR
Để đánh giá độ chụm và độ đúng của phƣơng pháp HG – AAS – PCR, các mẫu tự tạo và mẫu nƣớc mặt lấy từ hiện trƣờng (phƣờng Định Cơng – Hồng Mai – Hà Nội) đƣợc phân tích lặp 3 lần. Độ đúng đƣợc đánh giá thơng qua chuẩn student (ttính), độ chụm đƣợc đánh giá thông qua hệ số biến thiên (CV%) của phép phân tích lặp. Kết quả tính hàm lƣợng các dạng và các thơng số trên đƣợc trình bày ở bảng 3.26.
Bảng 3. 26. Kết quả tính độ đúng của phương pháp HVG – AAS – PCR
Mẫu, thông số Mẫu tự tạo Mẫu nƣớc mặt
As(III) As(V) DMA MMA As(III) As(V) DMA MMA
1 Trung bình (n=3) 5,0 4,8 2,8 2,8 2,8 8,5 0,6 <LOD Độ lệch chuẩn 0,21 0,15 0,06 0,15 0,15 0,25 0,06 - CV% 4,1 3,2 2,0 5,4 5,5 3,0 9,1 - ttính (tbảng = 2,45) 0,33 0,24 0,09 0,24 0,84 0,78 0,69 - 2 Trung bình (n=3) 10,0 9,8 4,8 4,9 3,3 7,0 0,7 0,5 Độ lệch chuẩn 0,25 0,06 0,06 0,15 0,15 0,15 0,72 0,49 CV% 2,5 0,6 1,2 3,1 4,6 2,2 0,7 0,5 ttính (tbảng = 2,45) 0,40 0,09 0,09 0,24 1,12 0,86 0,93 1,20
Se Se(IV) Se(VI) DMDSe SeMet Se(IV) Se(VI) DMDSe SeMet
1
Trung bình (n=3) 4,9 4,9 2,9 2,8 <LOD <LOD <LOD <LOD
Độ lệch chuẩn 0,15 0,15 0,15 0,06 - - - -
CV% 3,1 3,1 5,2 2,0 - - - -
ttính (tbảng = 2,45) 0,24 0,24 0,24 0,09 - - - -
2
Trung bình (n=3) 9,7 9,6 5,0 4,8 <LOD LOD <LOD LOD
Độ lệch chuẩn 0,06 0,06 0,12 0,06 - - - -
CV% 0,6 0,6 2,3 1,2 - - - -
Các kết quả tính ở bảng 3.26 cho thấy tất cả các giá trị ttính đều nhỏ hơn tbảng nên có thể kết luận rằng các giá trị trung bình này đều khơng sai khác có nghĩa với giá trị thực, các giá trị CV% đều nhỏ và nằm trong giới hạn của phép phân tích lƣợng vết (<10%). Nhƣ vậy, phƣơng pháp phân tích cho độ chụm và độ đúng cao.
Tóm lại, phƣơng pháp HG – AAS – PCR có độ đúng, độ chụm, độ tin cậy và độ nhạy cao, hoàn toàn áp dụng tốt để xác định đồng thời các dạng As, Se trong các mẫu thực tế. Các mơ hình hồi quy này sẽ đƣợc chúng tôi áp dụng trong các nghiên cứu tiếp theo. Các bƣớc tiến hành đƣợc tóm tắt ở hình 2.1 và 2.2, các điều kiện đo của máy AAS đƣợc tóm tắt ở bảng 2.1, mơi trƣờng thực hiện phản ứng hiđrua hóa với As là HCl 6M, 1M và đệm tactric/tactrat có pH = 2, 3, 4; còn với Se là HCl 6M, 4M, 2M, 1M và pH = 2.
3.4. Nghiên cứu các điều kiện bảo quản mẫu phân tích
Trong q trình phân tích dạng, khi các mẫu chƣa đƣợc đo tín hiệu ngay, các phản ứng hóa học xảy ra sẽ làm thay đổi hiện trạng hiện có của các dạng so với lúc đầu, ngồi ra các dạng cịn bị giảm do hấp phụ của vật liệu bình chứa. Vì vậy, cần phải khảo sát các điều kiện bảo quản mẫu trong lúc mẫu chƣa đƣợc đo tín hiệu.
3.4.1. Ảnh hƣởng của vật liệu bình chứa
Để khảo sát ảnh hƣởng của vật liệu bình chứa, các loại cốc có dung tích 100ml làm bằng thủy tinh, nhựa PE, nhựa Teflon đƣợc chuẩn bị. Các loại cốc này do hãng Bomex (Đức) sản xuất. Các dung dịch trong cốc đều chứa các dạng của từng nguyên tố khảo sát, chúng đƣợc đặt trong hộp nhựa, hộp đƣợc thổi khí nitơ khoảng 5 phút trƣớc khi đậy kín tránh oxi xâm nhập và đƣợc bảo quản trong tủ lạnh ở 40C. Sau mỗi 4h, 5,0 ml dung dịch trong mỗi cốc đƣợc lấy cho vào bình định mức 25ml, định mức bằng nƣớc cất đã đƣợc chuẩn bị trƣớc theo mục 2.1.2. Sau khi lấy dung dịch, khí nitơ đƣợc nhanh chóng đƣợc thổi vào hộp khoảng 5 phút, dung dịch tiếp tục đƣợc bảo quản trong tủ lạnh ở 40C.
Hàm lƣợng các dạng As, Se đƣợc xác định bằng phƣơng pháp HG – AAS – PCR, còn hàm lƣợng tổng As, Se đƣợc xác định bằng phƣơng pháp HG – AAS sau
Se và tổng As, Se đƣợc tính theo cơng thức 2.21 sau khi đã nhân với hệ số pha loãng mẫu. Các kết quả đƣợc biểu diễn trên hình 3.3.
Hình 3. 3. Ảnh hưởng của vật liệu bình chứa đến hàm lượng các dạng As, Se
ĐKTN: As(III) = 100ppb; As(V) = 100ppb; DMA = 50ppb; MMA = 50ppb Se(IV) = 50ppb; Se(VI) = 50ppb; DMDSe = 30ppb; SeMet = 50ppb
Qua đồ thị hình 3.3, dễ nhận thấy với vật liệu bình chứa bằng thủy tinh thì sau 10h hàm lƣợng các dạng của các nguyên tố khảo sát đều bị mất khá lớn, hiệu suất
cốc làm bằng nhựa PE và Teflon sau 40h lƣợng hao hụt không nhiều (H ≥ 90%). Có thể ở bề mặt thủy tinh xuất hiện lớp silic hiđroxit do sự thủy phân tạo ra đã hấp thu các dạng As, Se nhƣng không làm biến đổi chúng. Trong khi vật liệu PE và Teflon là những vật liệu hữu cơ tạo ra từ các chất không phân cực và rất bền nên không xảy ra hiện tƣợng này. Nhƣ vậy, để bảo quản mẫu lâu dài thì nên dùng các vật liệu làm từ PE hoặc Teflon. Kết quả trên cũng cho thấy thời gian lƣu mẫu có thể tới 40h.
3.4.2. Ảnh hƣởng của pH
Trong thí nghiệm này, pH đƣợc điều chỉnh bằng dung dịch NaOH 1,0 M và HCl 1,0 M, các dung dịch đƣợc đựng trong cốc Teflon, điều kiện thí nghiệm vẫn đƣợc giữ nguyên nhƣ thí nghiệm trƣớc. Kết quả tính hiệu suất thu hồi với hai khoảng thời gian khảo sát ngẫu nhiên là 8h và 24h đƣợc biểu diễn trên hình 3.4.
Hình 3. 4. Ảnh hưởng của pH đến sự tồn tại các dạng As, Se
ĐKTN: As(III) = 100ppb; As(V) = 100ppb; DMA = 50ppb; MMA = 50ppb Se(IV) = 50ppb; Se(VI) = 50ppb; DMDSe = 30ppb; SeMet = 50ppb
sinh, vì lúc đó xảy ra phản ứng trung hòa giữa ion OH- trong dung dịch mẫu với ion H+ trong dung dịch axit từ đó làm giảm hiệu suất khử các dạng. Kết quả trên cũng cho thấy các dạng khơng chuyển hóa lẫn nhau khi pH của dung dịch thay đổi. Để phù hợp với các mơi trƣờng đo đã lựa chọn trong mơ hình hồi quy, dung dịch mẫu nên duy trì ở khoảng pH = 4 – 8, đây cũng là khoảng pH cho thấy hàm lƣợng các dạng ổn định nhất. Do vậy, trong các thí nghiệm tiếp theo nƣớc cất đã chuẩn bị theo mục 2.1.2 đƣợc sử dụng để định mức và pha chế các dung dịch.
3.4.3. Ảnh hƣởng khi để dung dịch trong khơng khí
Oxi là một tác nhân oxi hóa có thể làm chuyển hóa các dạng As, Se có trong dung dịch. Để làm rõ vấn đề này, các thí nghiệm đƣợc tiến hành bằng cách để dung dịch chứa các dạng As, Se trong khơng khí cho oxi xâm nhập, pH của dung dịch bằng 2. Các điều kiện thực nghiệm khác vẫn đƣợc giữ nguyên nhƣ các thí nghiệm trƣớc. Kết quả thí nghiệm đƣợc biểu diễn trên hình 3.6.
Hình 3. 5. Ảnh hưởng của khơng khí đến sự tồn tại các dạng As, Se
ĐKTN: t0 = 40C
As(III) = 100ppb; As(V) = 100ppb; DMA = 50ppb; MMA = 50ppb Se(IV) = 50ppb; Se(VI) = 50ppb; DMDSe = 30ppb; SeMet = 50ppb
Qua đồ thị hình 3.6 dễ dàng nhận thấy hàm lƣợng các dạng DMA, MMA, DMDSe thay đổi khơng dáng kể vì sau 40h hiệu suất thu hồi vẫn lớn hơn 90%. Có thể do đây là các dạng hữu cơ chứa các gốc metyl (CH3-) bền với các tác nhân oxi hóa. Cịn dạng As(III), As(V), Se(IV), Se(VI), SeMet có hàm lƣợng thay đổi rõ rệt
As(III), Se(IV), SeMet giảm đi. Điều này hoàn toàn phù hợp với rất nhiều kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả đã công bố [37, 60] và cũng phù hợp với kết quả thí nghiệm cách ly dung dịch chứa các dạng As, Se với khơng khí ở mục 3.4.3. Nhƣ vậy, trong q trình phân tích các dạng As, Se nhất thiết khơng để khơng khí xâm nhập. Biện pháp đơn giản là cho các dung dịch vào hộp cách ly với khơng khí, hộp này có vịi dẫn khí nitơ đƣợc mở trong suốt q trình đo và bảo quản.
3.4.4. Ảnh hƣởng của ion Fe3+
Ion Fe3+ có tính chất là một tác nhân oxi hóa [46], ion này thƣờng có mặt trong các mẫu môi trƣờng ở hàm lƣợng đáng kể nên sẽ ảnh hƣởng đến sự tồn tại của các dạng As, Se. Để khảo sát ảnh hƣởng của ion Fe3+, dung dịch chuẩn Fe3+ đƣợc thêm vào các dung dịch chứa các dạng As, Se với hàm lƣợng thay đổi. Các dung dịch đƣợc bảo quản trong hộp kín khơng cho khơng khí xâm nhập, các điều kiện khác vẫn đƣợc cố định nhƣ các thí nghiệm trƣớc. Kết quả khảo sát sự biến đổi hàm lƣợng các dạng As, Se trong khoảng thời gian 10h đƣợc biểu diễn trên hình 3.7.
Hình 3. 6. Ảnh hưởng của ion Fe3+
đến sự chuyển dạng của các nguyên tố As, Se
ĐKTN: t0 = 40C; thời gian bảo quản 10h
As(III) = 100ppb; As(V) = 100ppb; DMA = 50ppb; MMA = 50ppb Se(IV) = 50ppb; Se(VI) = 50ppb; DMDSe = 30ppb; SeMet = 50ppb
Kết quả trên hình 3.7 cho thấy hiệu suất thu hồi của As(III), Se(IV), SeMet giảm dần còn của As(V), Se(VI) tăng dần, trong khi của DMA, MMA thay đổi không đáng kể. Nhƣ vậy, có sự chuyển hóa As(III) thành As(V) và Se(IV), SeMt
hàm lƣợng Fe3+ khoảng trên 200ppb mới thay đổi rõ rệt, còn với dung dịch chứa các dạng Se thì ngay ở khoảng nồng độ xấp xỉ 50ppb đã thay đổi đáng kể. Kết quả này cũng phù hợp với một số các kết quả nghiên cứu đã cơng bố trƣớc đây, sự có mặt của ion Fe3+ đƣợc cho là một tác nhân oxi hóa làm chuyển hóa các dạng nguyên tố có hóa trị thấp hơn lên hóa trị cao hơn [53, 61].
Để loại trừ ảnh hƣởng của Fe3+
cần một chất tạo phức bền với ion này, mục đích làm giảm thế oxi hóa khử của cặp Fe3+/Fe2+ từ đó giảm khả năng oxi hóa của ion Fe3+. Các nghiên cứu trƣớc đây cho thấy, EDTA là một thuốc thử hữu cơ tạo phức bền với Fe3+ [70,77] và đây cũng là một hóa chất khá phổ biến trong các phịng thí nghiệm. Chính vì vậy, các thí nghiệm đƣợc tiến hành bằng cách thêm lƣợng EDTA vào dung dịch chứa các dạng As, Se đã có sẵn lƣợng Fe3+
với hàm lƣợng 500ppb, các điều kiện thực nghiệm khác đƣợc cố định nhƣ các thí nghiệm trƣớc. Kết quả nghiên cứu đƣợc biểu diễn trên hình 3.8.
Hình 3. 7. Độ thu hồi khi sử dụng EDTA loại trừ ảnh hưởng của ion Fe3+
ĐKTN: t0 = 40C, Fe3+ = 500ppb, thời gian bảo quản 10h As(III) = 100ppb; As(V) = 100ppb; DMA = 50ppb; MMA = 50ppb
Se(IV) = 50ppb; Se(VI) = 50ppb; DMDSe = 30ppb; SeMet = 50ppb
Qua đồ thị hình 3.8, các đƣờng biểu diễn cho thấy khi có mặt EDTA ở mức ≥ 0,2M hiệu suất thu hồi các dạng As, Se đều gần bằng nhau và gần nhƣ thay đổi khơng đáng kể. Một thí nghiệm khác, để đánh giá ảnh hƣởng của EDTA đến sự tồn tại của các dạng As và Se, ion Fe3+
không đƣợc thêm vào mà chỉ có EDTA đƣợc thêm vào với hàm lƣợng 0,2M. Kết quả EDTA không làm thay đổi hàm lƣợng các
Do đó trong q trình bảo quản mẫu phân tích dạng cần cho thêm EDTA với hàm lƣợng tối thiểu trong dung dịch là 0,2M. Với những mẫu có hàm lƣợng Fe3+ lớn hơn 500ppb thì cần tăng thêm lƣợng EDTA cho phù hợp.
Nhƣ vậy, các điều kiện để bảo quản mẫu phân tích cho q trình phân tích dạng As, Se đƣợc rút ra nhƣ sau: vật liệu bảo quản là PE hoặc Teflon; các dung dịch cần phải cách ly với khơng khí; cần cho thêm EDTA với nồng độ tối thiểu là 0,2M; thời gian bảo quản mẫu tối đa 40h ở nhiệt độ 40C.
3.5. Nghiên cứu quá trình xử lý mẫu phân tích dạng
Các mẫu môi trƣờng đƣợc lựa chọn là mẫu nƣớc ngầm, nƣớc mặt; mẫu đất bùn; mẫu rau và cây thân thảo (mẫu thực vật). Đây là các mẫu thƣờng ảnh hƣởng trực tiếp đến sinh hoạt hàng ngày của ngƣời dân. Do phƣơng pháp phân tích HG – AAS – PCR không cần tách riêng các dạng, nên với mẫu nƣớc không phải qua giai đoạn xử lý trƣớc khi phân tích, các mẫu khác cần phải tiến hành q trình trích ly các dạng phân tích ra khỏi mẫu.
Các kết quả nghiên cứu trƣớc đây [31 - 34, 58, 71] đã đƣa ra quy trình chiết rút các hợp chất của As, Se bằng dịch chiết Metanol – nƣớc (MeOH:H2O) cho mẫu thực vật; và dùng dung dịch H3PO4 cho mẫu bùn đất. Kế thừa các kết quả đó, chúng tơi tiến hành khảo sát lại các điều kiện chiết rút với các mẫu thu thập đƣợc từ hiện trƣờng (Định Cơng – Hồng Mai – Hà Nội). Các quy trình chiết rút đƣợc thực hiện bằng máy rung siêu âm cho mẫu thực vật, còn mẫu bùn đất thực hiện bằng máy rung lắc để tăng hiệu quả chiết rút.
3.5.1. Khảo sát quá trình chiết rút As, Se với mẫu đất, bùn
Cơ chế chiết các dạng As, Se trong các mẫu bùn đất dựa vào phản ứng trao đổi giữa ion photphat và các dạng As, Se. Tốc độ chiết mẫu, hiệu suất chiết phụ thuộc rất nhiều vào nồng độ axit H3PO4, thời gian chiết và số lần chiết lặp. Các mẫu sau xử lý sơ bộ nhƣ mô tả ở mục 2.2.2 đƣợc thực hiện quá trình chiết trên máy rung lắc. Căn cứ vào kết quả khảo sát ở mục 3.4.4, để tránh sự biến đổi các dạng trong quá trình xử lý mẫu, EDTA đƣợc thêm vào dịch chiết mẫu với nồng độ trong là 0,2M.
điều kiện khác nhƣ nhiệt độ, tốc độ rung lắc đƣợc cố định. Dịch chiết sau mỗi lần chiết đƣợc xác định hàm lƣợng các dạng As, Se bằng phƣơng pháp HG – AAS – PCR; còn hàm lƣợng tổng As, Se trong dịch chiết và trong mẫu ban đầu đƣợc xác định bằng phƣơng pháp HG – AAS sau khi mẫu đã đƣợc vơ cơ hóa. Kết quả xác định nồng độ 4 dạng As, Se khảo sát và tổng As, Se trong dịch chiết đƣợc thể hiện qua các hình 3.9, 3.10.
Hình 3. 9. Khả năng chiết các dạng Se ra khỏi mẫu bùn đất bằng H3PO4
ĐKTN: rung lắc 5000 vòng/phút, li tâm 2000 vịng/phút, t0=250C
Kết quả biểu diễn trên hình 3.9 và 3.10 nhìn chung cho thấy tổng hàm lƣợng 4 dạng As, Se khảo sát thấp hơn tổng hàm lƣợng As, Se có trong dịch chiết, tuy nhiên sự chênh lệch khơng nhiều. Ngồi ra, ban đầu đƣờng biểu diễn hai loại hàm lƣợng As, Se này có xu hƣớng tăng lên, nhƣng khi nồng độ H3PO4 ≥ 100mM (với As)
đất ruộng 1 có Astổng = 23,3ppb; mẫu bùn ao 1 có Astổng = 23,7ppb; mẫu đất ruộng 2 có Setổng = 8,7 ppb; mẫu bùn ao 2 có Setổng = 8,9ppb) cho thấy còn có các dạng khác khơng đƣợc chiết ra, đây có thể là các dạng khó chiết ra theo cơ chế trao đổi của As, Se. Mặc dù vậy, tổng hàm lƣợng 4 dạng As, Se khảo sát xấp xỉ tổng hàm lƣợng As, Se trong dịch chiết nên có thể kết luận chúng đƣợc chiết rút gần nhƣ hồn tồn. Đồng thời cũng có thể khẳng định 4 dạng As, Se khảo sát chiếm thành phần chủ yếu trong dịch chiết.
Căn cứ vào các đồ thị hình 3.9 và 3.10, các thơng số tối ƣu cho qúa trình xử lý mẫu bùn đất lựa chọn đƣợc là: nồng độ H3PO4 100mM cho As còn với Se là 120mM; thời gian chiết cho mỗi lần 6h; số lần chiết lặp 3. Dịch chiết sau các lần