CHƢƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.2.4. Xác định lồi và giới tính
Xác định loài
Để xác định các mẫu thu đƣợc thuộc lồi bị tót (Bos gaurus), bò rừng (Bos
javanicus), bị ni (Bos indicus hay Bos taurus), chúng tơi đã tiến hành phân tích
trình tự ADN một trong hai đoạn gen cytochrome b (cyt b) hoặc vùng D-loop của ADN ty thể.
Cặp mồi nhân đoạn gen cyt b có độ dài 274 bp đƣợc thiết kế bởi Hasanin và cộng sự 2006 [51] dựa trên trình tự của bị ni nhƣ sau:
L15612: 5’-CGATCAATYCCYAAYAAACTAGG-3’ H15915: 5’-TCTCCATTTCTGGTTTACAAGAC-3’
Phản ứng PCR đƣợc tiến hành trong tổng thể tích 25µl bao gồm: Đệm PCR 1x, 1,5mM MgCl2, 200µM mỗi loại dNTP (A,T,G,C), 0,2µM mỗi loại mồi xi, mồi ngƣợc, 1,5 Unit enzym Hot Sart Taq DNA Polymerase (Fermentas) và 100-200 ng ADN khuôn. Điều kiện phản ứng PCR đƣợc thực hiện theo các bƣớc: Trƣớc tiên ADN đƣợc biến tính ở 94oC trong 4 phút, tiếp theo đó với 32 chu kỳ, mỗi chu kỳ đƣợc thực hiện ở điều kiện nhƣ sau: biến tính ở 92o
C trong 1 phút, gắn mồi ở 520 C trong 1 phút, tổng hợp chuỗi ADN ở 720C trong 1 phút 20 giây. Cuối cùng kết thúc phản ứng ở 720
C trong 10 phút.
Cặp mồi nhân đoạn ADN vùng D-loop đƣợc áp dụng từ cặp mồi đã đƣợc chúng tơi thiết kế và sử dụng cho bị ni có kích thƣớc 990 bp.
Mồi xi: 5’-ACTAGGCATTTTCAGTGCCTTGCTT-3’ Mồi ngược: 5’-CCCAAAGCTGAAGTTCTATTTAAACTA-3’
Thành phần và điều kiện phản ứng PCR nhân vùng D-loop đƣợc thực hiện nhƣ đã tiến hành đối với các mẫu bị ni, chỉ có một sự thay đổi nhỏ đó là nồng độ ADN khuôn đƣợc tăng gấp 2 lần so với ở bị ni.
Xác định giới tính
Chúng tơi sử dụng cặp mồi dùng để xác định giới tính phơi bị ni đƣợc thiết kế bởi Kageyama và cộng sự (2004) [59] có trình tự sau:
S4BF: 5’-CAAGTGCTGCAGAGGATGTGGAG-3’
S4BR: 5’-GAGTGAGATTTCTGGATCATATGGCTACT-3’
Điều kiện phản ứng PCR đƣợc tiến hành trong tổng thể tích 25 µl bao gồm: Đệm PCR 1x, 1,5mM MgCl2, 200µM mỗi loại dNTP (A,T,G,C), 0,2µM mỗi loại mồi xi, mồi ngƣợc, 50-100 ng ADN khuôn và 1,5 Unit Taq DNA polymerase
(Qiagen-Đức). Phản ứng PCR đƣợc thực hiện theo các bƣớc: Trƣớc tiên ADN đƣợc biến tính ở 94o
C trong 4 phút, tiếp theo đó với 32 chu kỳ, mỗi chu kỳ đƣợc thực hiện ở điều kiện nhƣ sau: biến tính ở 92o
C trong 1 phút, gắn mồi ở 52o
C trong 1 phút, tổng hợp chuỗi ADN ở 72oC trong 1 phút 20 giây. Cuối cùng kết thúc phản ứng ở 72oC trong 10 phút. Sản phẩm PCR sau đó đƣợc xác định trên điện di agarose 3%.
Sản phẩm PCR của cặp mồi này sẽ là một đoạn gen đặc trƣng trên nhiễm sắc thể Y của bị có kích thƣớc 178 bp và một đoạn gen khác có ở cả hai giới tính đực và cái có kích thƣớc 145 bp.