2.2.1.4. Phương pháp phân tích đa dạng di truyền hệ gen ty thể Nhân ADN đặc hiệu (PCR) vùng D-loop
Vùng ADN D-loop ty thể có kích thƣớc 990 bp đƣợc tiến hành nhân bản bởi phản ứng PCR trên 26 mẫu bò thuộc các huyện Đồng Văn, Mèo Vạc, Xín Mần và Hồng Su Phì của tỉnh Hà Giang. Cặp mồi đặc hiệu sử dụng để nhân bản vùng D- loop ở bị do chúng tơi thiết kế có trình tự nhƣ sau:
Mồi xi: 5’-ACTAGGCATTTTCAGTGCCTTGCTT-3’ Mồi ngược: 5’-CCCAAAGCTGAAGTTCTATTTAAACTA-3’
Phản ứng PCR đƣợc tiến hành trong tổng thể tích 50µl bao gồm: Đệm PCR 1x, 1,5mM MgCl2, 200µM mỗi loại dNTP (A,T,G,C), 0,2µM mỗi loại mồi xuôi, mồi ngƣợc, 1,5 Unit enzym Hot Sart Taq DNA Polymerase (Fermentas) và 50-100
ng ADN khuôn. Phản ứng PCR đƣợc thực hiện theo các bƣớc: Trƣớc tiên ADN đƣợc biến tính ở 94oC trong 4 phút, tiếp theo đó với 32 chu kỳ, mỗi chu kỳ đƣợc thực hiện ở điều kiện nhƣ sau: biến tính ở 92oC trong 1 phút, gắn mồi ở 55o
C trong 1 phút, tổng hợp chuỗi ADN ở 72oC trong 1 phút 20 giây. Cuối cùng kết thúc phản ứng ở 72o
C trong 10 phút.
Giải trình tự ADN vùng D-loop
Sản phẩm PCR sau đó đƣợc tinh sạch bằng bộ kít tinh sạch (QIAquick PCR Purification kit) của hãng Qiagen (Đức).
Phản ứng giải trình tự đƣợc thực hiện trực tiếp từ các sản phẩm PCR sau khi đã đƣợc tinh sạch với cả 2 mồi xi và ngƣợc, sử dụng bộ kít giải trình tự (DTCS- Quick Start Master Mix) của hãng Beckman Coulter-Mỹ. Trình tự các nucleotide đƣợc tiến hành xác định trên máy giải trình tự CEQ8000.
Phân tích trình tự
Trình tự nucleotide vùng D-loop ty thể của 26 mẫu bị tại Hà Giang đƣợc so sánh với trình tự có sẵn trên ngân hàng gen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank)
của các mẫu bò Nhật Bản, Hàn Quốc, Ấn Độ, Châu Âu, Châu Phi, bị rừng Mỹ (Bos
binson) và trình tự tồn bộ ADN ty thể của hai mẫu bị khơng có u (Bos taurus) và
có u (Bos indicus) đối chứng có mã truy cập trên ngân hàng gen tƣơng ứng là V00654 và NC-005971 sử dụng công cụ CLUSTALW của phần mềm BIOEDIT phiên bản 5.0.9 (Hall, 2001) [48] và DNAsp phiên bản 4.0 (Rozas và cộng sự, 2003) [113].
Khoảng cách di truyền dựa trên sự sai khác trình tự vùng D-loop ty thể giữa các quần thể bị đƣợc tính theo phƣơng pháp của Tamura và Nei (1993) [127]. Cây phân loại (phylogenetic tree) thể hiện mối quan hệ di truyền giữa các cá thể bò đƣợc xây dựng bằng phần mềm MEGA phiên bản 4.0 (Tamura và cộng sự, 2007) [126].
2.2.1.5. Phương pháp phân tích thống kê di truyền
Ước lượng một số chỉ số liên quan đến tính đa dạng di truyền
Số lƣợng alen của mỗi locút và trung bình số alen trên mỗi locút của tồn bộ quần thể đƣợc ƣớc lƣợng bằng phần mềm Genetix phiên bản 4.0.5.2. (Belkhir và công sự 2004) [17].
Tần số dị hợp tử lý thuyết (Hep), dị hợp tử quan sát (Hob) đƣợc ƣớc lƣợng bằng phần mềm Genetix (phiên bản 4.0.5.2).
Hệ số sai khác di truyền (FST) theo Weir (1984) [140] và khoảng cách di truyền (Ds) theo Nei (1972) [102] giữa các quần thể bò phân bố ở các huyện đƣợc ƣớc lƣợng bằng phần mềm Genetix (phiên bản 4.0.5.2).
Hệ số cận huyết (Fis) của từng locút và trung bình của tồn bộ các locút trên quần thể đƣợc ƣớc lƣợng bằng phần mềm Genetix (phiên bản 4.0.5.2).
Giá trị thơng tin đa hình (PIC) của mỗi locút đƣợc tính theo Botstein và cộng sự (1980) [25].
Bảng 2.2: Cơng thức tính một số giá trị thống kê của quần thể
Chỉ số Cơng thức tính
Tần số alen của locút
2N A 2 k 1 j j i i i i A A A p
Trong đó: pi là tần số của alen i ; AiAi, AiAj tƣơng ứng là số cá thể mang đồng hợp tử và dị hợp tử với alen i; k là
số lƣợng alen của locút ; N là số lƣợng cá thể Tần số dị hợp tử lý
thuyết (mong đợi)
1 2 1 2 1 2 N p N H k i i ep
Trong đó: Hep là tần số dị hợp tử lý thuyết của một locút;
pi là tần số của alen i; k là số lƣợng alen của locút; N là số lƣợng cá thể.
Giá trị thông tin đa hình (PIC) của mỗi locút 1 1 1 2 2 1 2 2 1 k i k i j j i k i i p p p PIC
Trong đó: pi, pj là tần số của alen i và j; k là số lƣợng alen của mỗi locút
Hệ số sai khác di truyền FST = T ep S ep T ep H H H , , ,
Trong đó: Hep,T là tần số dị hợp tử lý thuyết của tổng quần thể; Hep,S là tần số dị hợp tử của quần thể nhỏ (subpopulation) phân bố ở các huyện
Hệ số cận huyết
Fis =
Hep Hob Hep
Trong đó: Hep là tần số di hợp tử lý thuyết; Hob là tần số di hợp tử quan sát. Khoảng cách di truyền (Ds) Nei (1972) L i K j L i k j L i K j ijy P ijx P PijxPijy Ds 1 1 1 1 2 2 1 1 ln
Trong đó: Pijx, Pijy là tần số alen j tại locút i ở nhóm bị x và y tƣơng ứng; K là số alen tại locút i; L là số locút
Kiểm tra tính cân bằng di truyền Hardy-Weinberg
Độ phù hợp với cân bằng di truyền theo Hardy-Weinberg của từng locút và toàn bộ các locút trên quần thể đƣợc kiểm tra bằng phép thử “khi bình phƣơng” (χ2
), so sánh giữa tần số dị hợp tử quan sát và tần số dị hợp tử theo lý thuyết của từng locút đƣợc tính theo cơng thức:
χ2 = Hep Hep Hob )2 (
Trong đó: Hob là tần số di hợp tử quan sát; Hep là tần sô dị hợp tử theo lý
thuyết.
Giá trị χ2
càng nhỏ thì mức độ phù hợp càng cao, ngƣợc lại mức độ sai lệch giữa hai số liệu trên là bằng chứng cho thấy không cân bằng theo Hardy-Weinberg. Phép kiểm tra này đƣợc thực hiện bởi phần mềm Genetix và GENEPOP phiên bản 3.4 (Raymond và Rousset, 2004) [110].
Kiểm tra mối tương quan giữa khoảng cách di truyền với khoảng cách địa lý
Để tiến hành phép kiểm tra này, trƣớc tiên tiến hành thiết lập một ma trận thể hiện khoảng cách di truyền và khoảng cách địa lý giữa các nhòm bò phân bố trên 28 xã nghiên cứu.
Trong đó một nửa ma trận thể hiện mối quan hệ về khoảng cách di truyền giữa các nhóm bị ở 28 xã, một nửa khác thể hiện mối quan hệ về khoảng cách địa lý giữa 28 xã. Khoảng cách địa lý giữa các xã đƣợc tính dựa trên vị trí địa lý đã đƣợc xác định bằng phƣơng pháp định vị toàn cầu (GPS) của từng xã.
Sau đó sử dụng phép thử Mantel (Mantel test) của phần mềm Genetix để kiểm tra mối tƣơng quan này. Nếu kết quả phép kiểm tra có ý nghĩa thống kê với p < 0.05 thì có nghĩa là có sự tƣơng quan giữa khoảng cách di truyền và khoảng cách địa lý. Ngƣợc lai nếu p > 0,05 nghĩa là khơng có sự tƣơng quan giữa hai yếu tố này (Mantel, 1967) [86].
Xác định cấu trúc di truyền quần thể
Phần mềm SRTUCTURE phiên bản 2.2 (Pritchard và cộng sự, 2000) [109] đƣợc sử dụng để xác định các nhóm (quần thể phụ) cá thể khác nhau về di truyền. Thuật toán của phần mềm là phƣơng pháp phân tích nhóm dựa trên mơ hình xác định các nhóm có tần số alen khác biệt. Trƣớc tiên thuật tốn giả thiết một mơ hình có số nhóm là K (trong đó K có thể chƣa biết trƣớc và đƣợc giả thiết bởi ngƣời sử dụng) trong đó mỗi nhóm K đƣợc mơ tả bởi một tập hợp tần số alen của từng locút. Sau đó thuật tốn sẽ tiến hành chỉ định các cá thể vào các nhóm trên cơ sở kiểu gen của tồn bộ các locút nghiên cứu. Số nhóm (K) đƣợc xác định bằng cách sử dụng phƣơng pháp tính xác suất a priori. Ngồi ra số nhóm K cịn đƣợc xác định dựa trên sự tƣơng đồng của giá trị xác suất của các lần chạy lặp lại tại mỗi giá trị K. Kết quả của phép phân tích đƣợc thể hiện ở dạng số và dạng đồ hoạ, trong đó ở dạng số sẽ thể hiện tỷ lệ hệ gen của từng cá thể hoặc quần thể có mối quan hệ ở mỗi nhóm đƣợc đƣa ra tƣơng ứng với giá trị K.
Để áp dụng mơ hình này để phân tích cấu trúc di truyền quần thể bị ni tại tỉnh Hà Giang, trƣớc tiên chúng tơi giả thiết bị ở Hà Giang có thể đƣợc phân thành 10 nhóm (K = 10). Tại mỗi giá trị K đƣợc tiến hành chạy lặp lại 10 lần, sau đó phân tích kết quả xác suất tại mỗi giá trị K. Tại giá trị K nào có xác suất [LnPr(X/K)] lớn nhất và ổn định nhất giữa các lần chạy lặp lại sẽ đƣợc lựa chọn là kết quả của phép phân tích.
Xây dựng cây phân loại di truyền (phylogenetic tree)
Cây phân loại (cây khoảng cách) là sự thể hiện đồ hoạ hay là bản đồ của ma trận khoảng cách di truyền giữa các cá thể, quần thể...Có một số phƣơng pháp xây dựng cây khoảng cách di truyên khác nhau, tuy nhiên hai phƣơng pháp đƣợc biết đến nhiều nhất đó là UPGMA (Unweighted Paired Group Method of Arithmetic Average) và NJ (Neighbor – Joining Method). Trong đó phƣơng pháp NJ thƣờng đƣợc sử dụng cho các cá thể hay quần thể có mối quan hệ di truyền gần gũi.
Cây phân loại thể hiện mối quan hệ di truyền giữa các quần thể bò phân bố ở 8 huyện dựa trên sự phân bố tần số alen của các locút microsatellite theo phƣơng pháp NJ đƣợc thực hiện bởi phần mềm POPULATION và TREEVIEW.
Cây phân loại thể hiện mối quan hệ di truyền của quần thể bò ở Hà Giang với một số quần thể bị khác dựa trên sự sai khác trình tự ADN vùng D-loop ty thể đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp NJ bằng phần mềm MEGA4.
2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu đối với quần thể bò hoang dã
2.2.2.1. Thu thập mẫu
Tổng cộng 555 mẫu phân và 1 mẫu da bò hoang dã ở Việt Nam đƣợc chúng tôi thu thập tại một số vƣờn Quốc gia và khu bảo tồn nhƣ: vƣờn Quốc Gia Bù Gia Mập, Vƣờn Quốc Gia Cát Tiên, Vƣờn Quốc Gia Yok Đôn, Vƣờn quốc gia Phong Nha Kẻ Bàng-Quảng Bình, khu bảo tồn thiên nhiên Ea Sô, khu bảo tồn thiên nhiên Krơng Trai và mẫu phân bị tót (Bos gaurus) tại Thảo Cầm Viên thành phố Hồ Chí Minh. Các mẫu phân này đƣợc bảo quản trong cồn 100% (ethanol) và trong dung dịch bảo quản RNA later của hãng Qiagen (Đức). Trong quá trình đi khảo sát và thu thập các mẫu phân ngoài thực địa, chúng tôi chỉ thu các mẫu phân còn tƣơi, ƣớc lƣợng thời gian từ khi con vật thải ra đến khi đƣợc thu thập vảo khoảng 1-5 ngày. Địa điểm thu thập mẫu phân thƣờng tập trung vào các khu vực đất có muối khống, trảng cỏ và gần nguồn nƣớc vì những nơi này bị hoang thƣờng tập trung nhiều nhất. Ngoại trừ mẫu phân tại Thảo Cầm Viên thành phố Hồ Chí Minh là biết rõ nguồn gốc về lồi, các mẫu phân bị hoang cịn lại đều khơng biết nguồn gốc chúng thuộc bó tót (Bos gaurus), bị rừng (Bos javanicus), bò xám (Bos souveli) hay bị ni (Bos indicus và Bos taurus).
Ngồi ra, chúng tơi cũng tiến hành thu thập và phân tích di truyền của 11 mẫu bị tót (Bos gaurus) và bò rừng (Bos javanicus) của các quốc gia khác nhƣ
Campuchia, Lào và Ấn độ đƣợc nuôi giữ tại một số vƣờn thú trên thế giới nhƣ: vƣờn thú Pari Cộng hồ Pháp (bị tót), vƣờn thú Maldrid- Tây Ban Nha (bị tót),
vƣờn thú Copenhagen- Đan Mạch (bị tót) và khu bảo tồn động vật hoang dã Phnom Tamao – Campuchia (bị tót và bị rừng) (Bảng 2.3).
Bảng 2.3: Địa điểm thu thập các mẫu sinh học của bò hoang dã
Địa điểm thu mẫu Loại mẫu Số lƣợng mẫu
Vƣờn quốc gia Cát Tiên-Đồng Nai Phân 520
Vƣờn quốc gia Bù Gia Mập-Bình Phƣớc Phân 8
Khu bảo tồn thiên nhiên Ea Sô-Đăk Lăk Phân 20
Vƣờn Quốc Gia Yok Đôn-Dăk Lăk Phân 4
Vƣờn quốc gia Phong Nha Kẻ Bàng-Quảng Bình
Phân 2
Khu bảo tồn thiên nhiên Krông Trai-Phú Yên Da đầu 1 Thảo Cầm Viên thành phố Hồ Chí Minh Phân bị tót 1
Vƣờn thú Pari - Cộng hồ Pháp Máu bị tót 2
Vƣờn thú Madrid -Tây Ban Nha Phân bị tót 4
Vƣờn thú Copenhagen - Đan Mạch Máu bị tót 2
Khu bảo tồn động vật hoang dã - Campuchia Máu bị tót (2) Máu bị rừng (1)
3
2.2.2.2. Tách chiết ADN từ mẫu phân
Quy trình tách chiết ADN từ các mẫu phân đƣợc chúng tôi sử dụng và cải tiến từ quy trình của bộ kít tách QIAamp DNA Stool Mini Kit của hãng Qiagen (Đức).
Bộ kít này cho phép tách chiết ADN từ nhiều nguồn khác nhau có trong mẫu phân nhƣ: vi khuẩn, thực vật và các tế bào biểu mô ruột của vật chủ.
Trong các mẫu phân của bị thải ra có chứa một lƣợng tế bào biểu mô ruột, tuy nhiên số lƣợng này là rất ít vì vậy để tăng khả năng thu đƣợc nguồn ADN, chúng tôi đã cải tiến ở một số bƣớc quy trình tách chiết của bộ kít nhƣ sau:
Thay vì sử dụng 200 mg mẫu phân theo quy trình của bộ kít chúng tơi đã sử dụng tăng lên đến 400 -500 mg. Nếu các mẫu đƣợc bảo quản ở dạng dung dịch thì sử dụng ly tâm để loại bỏ phần dịch chỉ giữ lại phần cặn.
Mỗi mẫu phân tiến hành tách chiết ADN làm 2 lần khác nhau sau đó mẫu ADN đƣợc gộp chung vào làm một ống.
Để ADN tủa tốt, sau khi thêm dung dịch ethanol lạnh, các mẫu tiếp tục đƣợc đặt vào khay đá trong 15 phút.
Trƣớc khi hoà tan ADN trong các màng lọc của bộ kít, dung dịch AE (QIAamp DNA Stool Mini Kit) đƣợc ủ đến nhiệt độ 700C.
Các bƣớc cịn lại đƣợc thực hiện theo quy trình khuyến cáo của bộ kít. Đối với các mẫu mơ và máu, chúng tơi áp dụng theo quy trình khuyến cáo của bộ kít tách ADN cho mẫu máu và mô nhƣ đã sử dụng cho các mẫu bị ni.
2.2.2.3. Xác đinh sự ảnh hưởng của một số yếu tố bảo quản mẫu phân đến kết quả tách chiết ADN
Để khảo sát sự ảnh hƣởng của một số yếu tố bảo quản mẫu: (1) nhiệt độ bảo quản mẫu, (2) dung dịch bảo quản mẫu, (3) thời gian bảo quan mẫu đến kết quả tách chiết ADN từ các mẫu phân bị hoang dã, chúng tơi đã tiến hành thí nghiệm trên mẫu phân bị tót (Bos gaurus) thu ở Thảo Cầm Viên thành phố Hồ Chí Minh. Các mẫu phân này đƣợc bảo quản trong các điều kiện khác nhau nhƣ ở bảng 2.4.
Bảng 2.4: Các điều kiện bảo quản mẫu phân bò nhằm xác định các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả tách chiết ADN
Điều kiện bảo quản mẫu phân
Nhiệt độ bảo quản (0C)
Dung dịch bảo quản
Thời gian bảo quản (ngày) 1 Khoảng 350C Không 2, 10, 20, 30 2 Khoảng 350C Cồn (100%) 2, 10, 20, 30 3 Khoảng 350C RNAlater 2, 10, 20, 30 4 40C Không 2, 10, 20, 30 5 40C Cồn (100%) 2, 10, 20, 30 6 40C RNA later 2, 10, 20, 30
2.2.2.4. Xác định lồi và giới tính Xác định lồi Xác định lồi
Để xác định các mẫu thu đƣợc thuộc lồi bị tót (Bos gaurus), bị rừng (Bos
javanicus), bị ni (Bos indicus hay Bos taurus), chúng tơi đã tiến hành phân tích
trình tự ADN một trong hai đoạn gen cytochrome b (cyt b) hoặc vùng D-loop của ADN ty thể.
Cặp mồi nhân đoạn gen cyt b có độ dài 274 bp đƣợc thiết kế bởi Hasanin và cộng sự 2006 [51] dựa trên trình tự của bị ni nhƣ sau:
L15612: 5’-CGATCAATYCCYAAYAAACTAGG-3’ H15915: 5’-TCTCCATTTCTGGTTTACAAGAC-3’
Phản ứng PCR đƣợc tiến hành trong tổng thể tích 25µl bao gồm: Đệm PCR 1x, 1,5mM MgCl2, 200µM mỗi loại dNTP (A,T,G,C), 0,2µM mỗi loại mồi xi, mồi ngƣợc, 1,5 Unit enzym Hot Sart Taq DNA Polymerase (Fermentas) và 100-200 ng ADN khuôn. Điều kiện phản ứng PCR đƣợc thực hiện theo các bƣớc: Trƣớc tiên ADN đƣợc biến tính ở 94oC trong 4 phút, tiếp theo đó với 32 chu kỳ, mỗi chu kỳ đƣợc thực hiện ở điều kiện nhƣ sau: biến tính ở 92o
C trong 1 phút, gắn mồi ở 520 C trong 1 phút, tổng hợp chuỗi ADN ở 720C trong 1 phút 20 giây. Cuối cùng kết thúc phản ứng ở 720
C trong 10 phút.
Cặp mồi nhân đoạn ADN vùng D-loop đƣợc áp dụng từ cặp mồi đã đƣợc chúng tơi thiết kế và sử dụng cho bị ni có kích thƣớc 990 bp.
Mồi xuôi: 5’-ACTAGGCATTTTCAGTGCCTTGCTT-3’ Mồi ngược: 5’-CCCAAAGCTGAAGTTCTATTTAAACTA-3’
Thành phần và điều kiện phản ứng PCR nhân vùng D-loop đƣợc thực hiện nhƣ đã tiến hành đối với các mẫu bị ni, chỉ có một sự thay đổi nhỏ đó là nồng độ