Chương 2 : VI SINH THỰC PHẨM
2.2. Phương pháp xác định
2.2.3. Phương pháp đếm trực tiếp bằng haemacytometter
Mật số các vi sinh vật đơn bào có kích thước lớn như nấm men, tảo… có thể dùng phương pháp này để xác định. Phương pháp này cho phép xác định nhanh mật độ vi sinh vật trong mẫu nhưng có nhược điểm là đếm cả tế bào sống và tế bào chết, dễ nhầm lẫn tế bào vi sinh vật với các vật thể khác trong mẫu, khơng thích hợp sử dụng để đếm những huyền phù vi sinh vật có mật số thấp.
Haemacytometter là một phiến kính dày 3 mm, vùng đĩa đếm nằm ở giữa phiến kính có độ sâu 0,2 mm và được bao quanh bởi các rãnh. Vùng đĩa đếm có thể tích chứa là 1ml và được chia thành 25 ô lớn (dài 0,25 mm, rộng 0,2 mm, độ sâu 0,2 mm), mỗi ô lớn được chia thành 20 ô vuông nhỏ.
20
- Khi thực hiện quan sát và đếm vi sinh vật, cho thêm vài giọt formalin vào trong mẩu và trơng đều. Cần pha lỗng mẫu sao cho mỗi ơ nhỏ của buồng đếm có khoảng 5-10 tế bào vi sinh vật.
- Thực hiện nhỏ một giọt mẫu đã pha lỗng vào vùng đếm trên haemacytometter, đậy lá kính lại, chỉnh kính hiển vi về vật kính X40, chỉnh thị trường của kính sao cho chứa trọn một ơ lớn (4x5 = 20 ô nhỏ).
Đếm số tế bào hiện diện trong một ơ lớn, sau đó chỉnh thị trường để tìm một ơ lớn khác, đếm số tế bào của 5 ô lớn và lấy trị số trung bình.
* Cách tính mật số tế bào như sau:
– A: mật số vi sinh vật (tế bào/ml, tb/ml)
– n: số tế bào trung bình trong 1 ơ lớn
– f: độ pha loãng 2.2.4. Phương pháp màng lọc
- Phương pháp này thường được dùng để định lượng vi sinh vật chỉ thị trong mẫu nước. - Trước tiên, ta thực hiện quá trình lọc để tập trung vi sinh vật trong mẫu nước trên màng lọc (màng lọc có kích thước lỗ là 0,2μm hoặc 0,45μm được chế tạo từ các sợi thủy tinh siêu mảnh hoặc sợi polypropylene vơ trùng). Sau đó, xác định số lượng tế bào vi sinh vật dựa vào số khuẩn lạc đếm được sau khi đặt màng lọc lên trên mơi trường thạch có thành phần dinh dưỡng thích hợp cho loại vi sinh vật cần kiểm nghiệm.
- Dựa trên thể tích nước ban đầu và quy ước là mỗi khuẩn lạc được hình thành từ 1 tế bào vi sinh vật, ta quy ra số lượng vi sinh vật có trong một đơn vị thể tích.
- Ngồi màng lọc bình thường, hiện nay người ta còn sử dụng màng lọc lưới kỵ nước, trên đó có in các ơ vng bằng vật liệu kỵ nước. Mật số vi sinh vật trong mẫu nước được tính tốn và trình bày dưới dạng số có xác suất lớn nhất (MPN) của lượng vi sinh vật có trong một đơn vị thể tích mẫu phân tích.
- Mật số vi sinh vật: N = n x ln (n/(n-x)) MPN/ ml
n: Tổng số các ô vuông
21 2.2.5. Phương pháp đo độ đục huyền phù vi sinh vật
- Khi một pha lỏng có chứa nhiều phân tử khơng tan thì sẽ hình thành một hệ huyền phù và có độ đục do các phân tử hiện diện trong môi trường lỏng cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới.
- Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường cũng làm môi trường trở nên đục, độ đục của huyền phù tỷ lệ thuận với mật độ tế bào. Do đó, có thể định lượng mật độ tế bào một cách gián tiếp thông qua việc đo độ đục bằng máy so màu (spectrophotomettre) ở bước sóng trong khoảng từ 550-610 nm.
- Trước tiên cần phải thiết lập được đường quan hệ tuyến tính giữa độ đục và mật số tế bào. Thực hiện bằng cách sử dụng một số huyền phù tế bào có độ đục xác định, mật số tế bào của mỗi huyền phù này được xác định bằng một phương pháp trực tiếp khác.
+ Pha loãng huyền phù chứa vi sinh vật cần kiểm nghiệm thành các huyền phù có nồng độ pha loãng khác nhau. Đo độ đục (trị số DO) của các huyền phù vừa pha loãng, ghi kết quả.
+ Dùng phương pháp đếm trực tiếp dưới kính hiển vi hay phương pháp đếm khuẩn lạc để xác định mật số tế bào N (CFU/ ml) của các huyền phù trên.
22
Chương 3: HÓA HỌC THỰC PHẨM
3.1. Các yêu cầu đối với dạng kết tủa và dạng cân
3.1.1. Các yêu cầu đối với dạng kết tủa
- Kết tủa phải thực tế không tan, lượng nguyên tố cần phân tích còn lại trong dung dịch sau khi kết tủa phải nhỏ hơn 0,1mg tức là không được vượt quá độ nhạy của cân phân tích. Thực tế cho thấy rằng đối với các kết tủa loại AB (như BaSO4, AgCl…) thì tích số tan phải nhỏ hơn 108 mới sử dụng được, cịn tích số tan lớn hơn 10-8 thì khơng sử dụng. Do vậy khi tiến hành kết tủa ta phải nghiên cứu tìm những điều kiện tối ưu để chất phân tích kết tủa hồn tồn.
- Kết tủa tạo thành phải tinh khiết, nếu có chất lạ lẫn vào thì nó phải được loại trừ trong q trình lọc, rửa, sấy, nung.
- Kết tủa hình thành phải trong điều kiện như thế nào đó để dễ lọc, rửa.
- Dạng kết tủa phải chuyển thành dạng cân dễ dàng và hoàn toàn khi sấy hoặc nung.
3.1.2. Các yêu cầu đối với dạng cân
- Việc tính tốn kết quả phân tích là dựa vào khối lượng của dạng cân và cơng thức hóa học của nó nên yêu cầu quan trọng nhất đối với dạng cân là phải có thành phần cố định, đúng với cơng thức hóa học xác định.
Ví dụ: Al(OH)3 có dạng cân thường ngậm một số phân tử nước nên muốn chuyển thành dạng Al2O3, ta phải nung đến nhiệt độ trên 1.100oC. Trong trường hợp này ta có thể chọn dạng kết tủa là các muối bazơ của nhôm để chuyển thành Al2O3 ngay ở nhiệt độ 640oC hơn ở dạng Al(OH)3.
- Dạng cân phải khá bền về mặt hóa học nghĩa là trong khơng khí nó khơng bị hút ẩm, không tác dụng với oxi và khí cacbonic, khơng bị phân hủy do tác dụng của ánh sáng trong quá trình làm nguội và cân…
- Hàm lượng của nguyên tố xác định trong dạng cân càng nhỏ càng tốt, nghĩa là hệ số chuyển G/P càng bé càng tốt vì như vậy sai số mắc phải khi phân tích (do cân, do kết tủa bị tan khi rửa…) sẽ ít, tức là kết quả phân tích càng chính xác.
23 3.1.3. Các yêu cầu khác trong phân tích khối lượng
a) Thuốc thử trong phân tích khối lượng có thể là thuốc thử hữu cơ hay vơ cơ. Trong q
trình tạo kết tủa hiện tượng cộng kết xảy ra rất mạnh, trong số ion bị cộng kết có cả ion của thuốc kết tủa mà kh rửa cũng không rữa sạch hồn tồn được. Vì vậy cần chọn thuốc thử dễ bay hơi hoặc dễ phân hủy trong quá trinh nung sấy. Thuốc thử càng có độ chọn lọc cao càng tốt. Vì như vậy sẽ tránh được hiện tượng các kết tủa khác cùng kết tủa theo kết tủa chính.
Lượng thuốc thử cũng đóng vai trị rất quan trọng trong phương pháp khối lượng. Thực tế cho thấy
rằng không tồn tại kết tủa nào mà lại hồn tồn khơng tan trong nước.
Do vậy tích số tan ln lớn hơn 0. Khi kết tủa có độ tan khơng đủ nhỏ hoặc chất phân tích ở trong dung dịch khá loãng, để đảm bảo kết tủa hoàn toàn ta cần tăng lượng thuốn kết tủa để làm giảm độ tan của kết tủa.
b) Nồng độ thuốc thử: đối với thuốc thử là dạng vơ định hình hay tinh thể ta có những u cầu về nồng
độ khác nhau
- Kết tủa vơ định hình: với kết tủa vơ định hình thì tốt nhất là kết tủa từ các dung dịch đặc, nóng. Khi
làm kết tủa vơ định hình ta cần chú ý đến xu hướng để tạo thành dung dịch keo của chúng.
- Kết tủa tinh thể: với kết tủa là tinh thể để có kết tủa lớn hạt ta phải làm giảm độ quá bão hòa của dung
dịch bằng cách kết tủa từ dung dịch loãng. Để tăng độ tan S của kết tủa trong quá trình kết tủa người ta tăng nhiệt độ hay thêm chất nào đó để tăng độ tan. Vì tinh thể lớn có độ hịa tan bé nên dung dịch bão hòa đối với tinh thể lớn vẫn chưa bão hòa đối với tinh thể bé nên tinh thể bé phải tan ra. Lúc này dung dịch lại trở thành quá bão hòa đối với tinh thể lớn và chất tan lại bám lên bề mặt tinh thể lớn. Bây giờ dung dịch lại trở thành chưa bão hịa đối với tinh thể bé do đó tinh thể bé lại tiếp tục tan ra.
Nhiệt độ tăng sẽ làm tăng tốc độ làm muồi kết tủa. Sau khi làm muồi ta được không những một kết tủa dễ lọc mà còn tinh khiết hơn. Đối với các kết tủa keo kị nước thì hiệu quả này không rõ ràng lắm và trong một vài trường hợp còn cho kết quả xấu.
c) Lượng chất phân tích: lượng cân chất lấy để phân tích phải khơng quá nhỏ hoặc quá
lớn.
Lượng cân lớn quá sẽ thu được quá nhiều kết tủa và gây khò khăn cho việc lọc rửa nung. Trái lại lượng cân quá nhỏ thì dung dịch sau khi phá mẫu khá lỗng vá có thể khó tách hồn tồn chất cần phân tích, do đó kết quả phân tích sẽ khó chính xác.
Lượng cân phải lấy thế nào để cho lượng cân kết quả phân tích vào khoảng 0,01 đương lượng gram đối với kết tủa là tinh thể và 0,005 đương lượng gram đối với kết tủa là vơ định hình.
24
d) Nhiệt độ
Đối với kết tủa tinh thể thì việc đun nóng có tác dụng làm tăng độ tan, làm giảm độ quá bão hòa tương đối và giảm được số trung tâm kết tinh ban đầu, tạo được kết tủa to hạt. Đối với kết tủa vơ định hình, việc đun nóng giúp đơng tụ và làm to hạt.
Đối với kết tủa có độ tan tăng, khi đun nóng thì trước khi lọc phải làm nguội và phải rửa bằng nước rửa nguội. Đối với kết tủa keo có độ tan bé như Fe(OH)3 thì phải lọc nóng và rửa bằng nước rửa nóng để tránh peptid hóa.
3.2. Phương pháp phân tích thể tích
3.2.1. Nguyên tắc chung
Phương pháp phân tích thể tích là phương pháp phân tích định lượng dựa trên việc đo thể tích của dung dịch chuẩn VB (là dung dịch đã biết chính xác nồng độ) tác dụng vừa đủ với thể tích nhất định của chất cần phân tích VA (cịn gọi là chất định phân).
Phản ứng phân tích: A + B → sản phẩm, phản ứng này thỏa mãn 3 yêu cầu của phản ứng phân tích:
- Phản ứng xảy ra hoàn toàn theo 1 chiều.
- Phản ứng xảy ra nhanh khơng có sản phẩm phụ. - Có phương pháp xác định điểm tương đương.
Ví dụ: Xác định nồng độ của dung dịch NaOH bằng dung dịch chuẩn HCl 0,1M. + Lấy 10 ml dung dịch NaOH (A) cho vào bình nón.
+ Nhỏ 2, 3 giọt phenolphtalein → dung dịch màu hồng. + Lấy dung dịch HCl 0,1M cho vào buret, chỉnh về vạch số 0.
+ Nhỏ dần HCl từ buret vào bình nón lắc đều đến khi vừa mất màu, dừng lại, ghi thể tích đã tiêu tốn VHCl.
25
Hình 3.1: Buret dùng trong chuẩn độ dung dịch
3.2.2. Phương pháp trung hoà:
Các phương pháp này dựa trên phản ứng cơ bản là phản ứng trung hòa (acid-bazơ). 3.2.3. Phương pháp kết tủa
* Phản ứng chuẩn độ:
mXaq + nRaq XmRn¯ Ví dụ: Cl- + Ag+ AgCl ¯
Dạng kết tủa phải: ít tan, xuất hiện ngay lập tức. Mong muốn kết tủa ở dạng vơ định hình. Phản ứng phải xảy ra theo đúng tỷ lệ hợp thức.
* Chất chỉ thị và phân loại:
- Phương pháp bạc: Raq = Ag+ (từ AgNO3) - Phương pháp Mohr: Xaq = Cl-, Br
26
- Phương pháp sulfocyanua: Raq = SCN- (từ NH4SCN, KSCN)
- Phương pháp Volhard: Xaq = Ag+ (chuẩn độ trực tiếp); Xaq =Cl-, Br-, I- (chuẩn độ ngược)
Phương pháp Hg(I): Raq = Hg2(NO3)2, Xaq = Cl-
* Lưu ý: khi chuẩn độ phải khuấy trộn mạnh để thiết lập nhanh chóng cân bằng giữa hai pha rắn lỏng.
* Yêu cầu đối với phản ứng chuẩn độ kết tủa:
Trong pp chuẩn độ kết tủa thuốc thử R chỉ : ược phép cho vừa đủ để phản ứng với X tạo ra kết tủa XmRn. Không được phép cho thiếu hoặc cho dư R. Để ảm bảo độ úng và độ chính xác phản ứng chuẩn độ kết tủa phải thỏa mãn các yêu cầu sau:
- Kết tủa phải là chất rất ít tan (Ksp nhỏ)
- Phản ứng kết tủa phải xảy ra theo đúng tỉ lệ hợp thức (không quan tâm đến độ tinh khiết của kết tủa).
- Kết tủa phải được tạo thành ngay lập tức và tồn tại ở trạng thái rất phân tán để việc nhận màu dễ dàng hơn.
3.3. Xác định hàm lượng nitơ toàn phần
3.3.1. Nguyên lý
- Nitơ có trong thành phần các hợp chất hữu cơ. Dưới tác dụng của H2SO4 đậm đặc và sự hiện diện của chất xúc tác thích hợp thì tất cả các chất hữu cơ bị oxi hóa, cịn NH3 được giải phóng ra kết hợp với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4.
- Dùng một chất kiềm mạnh như NaOH, MgO đẩy NH3 từ muối (NH4)2SO4 thành ra thể tự do.
27 3.3.2. Tiến hành xác định
* Giai đoạn vơ cơ hóa:
- Giai đoạn này cần được tiến hành trong tủ hút hay nơi thống mát, tránh khí độc CO2, SO2 thốt ra.
- Cân thật chính xác khoảng 1gam thực phẩm, cho vào bình Kjeldahl với 10 ml dung dịch H2SO4 đậm đặc và khoảng 5 gam chất xúc tác.
- Để nghiêng bình Kjeldahl trên bếp và đun từ từ. Nếu thực phẩm chứa nhiều nước, đun cho đến khi nước bốc hơi và hình thành khói trắng SO2. Khi bọt tan, đun sôi cho đến khi dung dịch trong suốt khơng màu hoặc có màu xanh lơ của CuSO4. Để nguội và có thể pha
lỗng trong bình định mức 100ml. * Giai đoạn cất đạm:
- Chuẩn bị nước ở bình đun: Cho nước vào bình đun khoảng 2/3 thể tích bình, đun sơi nước trong bình đun.
- Chuẩn bị dung dịch ở bình hứng NH3: Cho vào bình hứng 20ml dung dịch acid boric,
đặt bình vào hệ thống sao cho đầu mút dưới của ống sinh hàn ngập trong dung dịch. * Phần hóa học:
Chuyển dung dịch đã vơ cơ hóa vào bình cầu của máy cất đạm, rửa bình kjeldahl hai lần với nước cất, nước rửa vào bình cầu. Cho NaOH 40% vào với liều lượng đủ dư (có thể dùng chất chỉ thị để theo dõi) để đẩy NH3 ra khỏi (NH4)2SO4. Đóng khóa nhanh và tiến hành cất đạm cho
đến khi dung dịch trong bình hứng đạt khoảng 80ml. Quá trình cất đạm có thể được xác định điểm kết thúc bằng cách dùng giấy quỳ để thử dung dịch ở đầu mút của ống sinh hàn, nếu giấy quỳ khơng đổi màu q trình cất đạm đã hồn thành. Dùng nước cất để rửa đầu mút của ống sinh hàn. Lấy bình hứng ra và tiếp tục quá trình chuẩn độ.
* Giai đoạn chuẩn độ.
Lượng BO2- được tạo thành trong bình hứng tương đương với lượng NH3 bị đẩy ra trong quá trình cất đạm. Xác định lượng BO2- bằng cách chuẩn độ ngược với H2SO4 0,1N. Giai đoạn chuẩn độ kết thúc từ màu xanh lá mạ sang màu tím đỏ.
3.3.3. Tính kết quả
Hàm lượng nitơ tồn phần theo phần trăm được tính theo cơng thức: Trong đó:
28 n: Số ml H2SO4 0,1N dùng để chuẩn độ mẫu thử. P: Trọng lượng mẫu thử, tính bằng g.
0,0014: Số gam nitơ tương đương với 1 ml H2SO4 0,1N
Hình 3.2: Hệ thống đốt đạm và cất đạm 3.4. Xác định hàm lượng NH3
3.4.1. Nguyên lý
Dùng kiềm nhẹ đẩy amoniac ra khỏi mẫu thử, chưng cất vào dung dịch axit sunfuric. Dựa vào lượng axit dư khi chuẩn độ bằng dung dịch natri hydroxyt 0,1N để tính hàm lượng