Cả 3 mẫu điện di đều có số vạch là như nhau, điều đó có nghĩa là xử lý siêu âm không làm mất đi những thành phần protein trong 3 mẫu khảo sát.
Cuối cùng chúng tôi tiến hành xác định độ hấp thu của 3 mẫu enzyme nói trên trong vùng UV. Kết quả được thể hiện ở Hình 3.4.
Mẫu 3 Mẫu 2 Mẫu 1 Protein chuẩn KDa 225 150 100 75 50 10 25 35
Hình 3.4. Độ hấp thu trong vùng UV của các mẫu enzyme được xử lý siêu âm ở những chế độ khác nhau
A: 250-270nm (phenylalanine), B: 270-290nm (tyrosine), C: 290-300nm (tryptophan)
Từ kết quả ở Hình 3.4, chúng tơi có một số nhận xét như sau:
+ Ứng với vùng bước sóng từ 190-250 nm (far-UV): mẫu siêu âm cho hoạt tính
enzyme cao nhất (đường màu đỏ) có độ hấp thu hầu như là không thay đổi so với mẫu
enzyme đối chứng không qua xử lý siêu âm. Điều này chứng tỏ rằng ở chế độ xử lý
này, sóng siêu âm hầu như khơng làm thay đổi cấu trúc bậc hai của enzyme (Sharon et
al., 2005). Kết quả này tương tự như kết quả nghiên cứu của Shah và Gupta (2008)
B
C A
trên đối tượng enzyme lipase được thu nhận từ Burkholderia cepacia. Các tác giả đã
tiền xử lý siêu âm lipase bằng sóng siêu âm và nhận thấy hoạt tính enzyme tăng.
Tuy nhiên, đối với mẫu xử lý siêu âm cho hoạt tính enzyme thấp nhất (đường màu xanh lá), độ hấp thu có thay đổi trong khoảng bước sóng từ 240-250 nm. Như vậy, với
chế độ xử lý này, cấu trúc bậc hai của enzyme đã có sự thay đổi, và sự thay đổi này theo chiều hướng bất lợi nên làm giảm hoạt tính xúc tác của chế phẩm enzyme sau khi xử lý bằng siêu âm (Kết quả thí nghiệm 3.1.1 và 3.1.2).
+ Ứng với vùng bước sóng từ 250-300 nm (near-UV): độ hấp thu sẽ tương ứng với sự hiện diện của các amino acid thơm như phenylalanine, tyrosine và tryptophan, trong
đó bước sóng từ 250-270 nm: phenylalanine, từ 270-290 nm: tyrosine, và 280-300 nm:
tryptophan (Sharon et al., 2005).
Đối chiếu với kết quả thực nghiệm (Hình 3.5): chúng tơi nhận thấy có sự khác biệt về độ hấp thu ở cả hai mẫu enzyme xử lý siêu âm cho hoạt tính cao nhất và cho hoạt tính
thấp nhất, đặc biệt là ở vùng có bước sóng từ 250-270 nm (phenylalanine); ở dãy bước sóng từ 270-290 nm: mẫu siêu âm cho hoạt tính enzyme thấp nhất có độ hấp thu khác biệt rõ nét hơn so với mẫu siêu âm cho hoạt tính cao nhất, và ở vùng bước sóng 290- 300 nm: hầu như độ hấp thu không khác biệt ở cả 3 mẫu.
Điều này chứng tỏ, tùy theo công suất và thời gian xử lý siêu âm mà sóng siêu âm đã làm thay đổi cấu trúc phân tử của enzyme trong chế phẩm Viscozyme L theo hai chiều hướng: có lợi cho sự tiếp xúc enzyme với cơ chất (hoạt tính enzyme tăng) và bất lợi
cho sự tiếp xúc enzyme với cơ chất (hoạt tính enzyme giảm).
3.1.3. Ảnh hưởng của nồng độ protein hòa tan của chế phẩm enzyme trước khi siêu âm
Trong thí nghiệm này, chế phẩm Viscozyme L được pha loãng với dung dịch đệm ở các tỷ lệ khác nhau. Nồng độ protein của các mẫu chế phẩm trước khi siêu âm dao
động trong khoảng từ 0.11 đến 0.54 mg/mL. Hoạt độ riêng của tất cả các mẫu là như
nhau và bằng 2.11±0.04 FBG/mg protein.
- Khi tăng nồng độ protein trong chế phẩm từ 0.11 mg/mL lên 0.22 mg/mL và
0.33mg/mL, hoạt tính riêng của chế phẩm sẽ tăng dần và đạt giá trị cực đại ở nồng độ protein 0.22 mg/mL và 0.33 mg/mL (Hoạt tính hemicellulase tăng lần lượt 22% và 21.1% so với mẫu enzyme đối chứng không qua xử lý siêu âm). Theo kết quả xử lý
thống kê, hai nghiệm thức có nồng độ protein 0.22 mg/mL và 0.33 mg/mL có hoạt tính
riêng hemicelulase là như nhau (P<0.05). Nếu tiếp tục tăng nồng độ protein trong mẫu
lên 0.44 mg/mL và 0.54 mg/mL, thì hoạt tính hemicellulase trong các mẫu sau khi xử lý siêu âm bị giảm đi (Hình 3.3, phụ lục C- Bảng C.3).
Hình 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ protein hòa tan trong mẫu enzyme trước khi đem siêu âm đến hoạt tính riêng của chế phẩm enzyme
Kết quả thu được chứng tỏ rằng nồng độ protein hòa tan trong chế phẩm enzyme có ảnh hưởng đến hoạt tính riêng của chế phẩm sau quá trình xử lý siêu âm. Tùy theo
nồng độ protein hòa tan trong mẫu là cao hay thấp mà mức độ thay đổi cấu hình khơng gian của phân tử protein sẽ khác nhau, kết quả là làm tăng hay giảm hoạt tính enzyme. Tổng kết các kết quả thực nghiệm từ các thí nghiệm 3.1.1, 3.1.2 và 3.1.3, chúng tôi rút
ra được thơng số thích hợp cho quá trình siêu âm để làm tăng hoạt tính chế phẩm
hemicellulase (Viscozyme L): công suất siêu âm 5.625 W/mL, thời gian siêu âm là 90s và nồng độ protein hịa tan thích hợp trong chế phẩm enzyme để xử lý siêu âm là 0.22 mg/mL.
3.2. Khảo sát quá trình xử lý sơ ri nguyên liệu đồng thời bằng sóng siêu âm và enzyme
Kết quả ở thí nghiệm 3.1 cho thấy, khi xử lý ở chế độ thích hợp thì sóng siêu âm có tác dụng làm tăng hoạt tính của chế phẩm enzyme hemicellulase (Viscozyme L). Đây là tiền đề để chúng tôi thực hiện tiếp thí nghiệm kết hợp đồng thời q trình xử lý nguyên liệu sơ ri bằng sóng siêu âm và chế phẩm hemicellulase. Thông số công nghệ mà
chúng tôi khảo sát ở đây chính là nồng độ chế phẩm enzyme hemicellulase
(Viscozyme L) và thời gian xúc tác enzyme.
3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzyme
Trong thí nghiệm này, chúng tơi thay đổi nồng độ chế phẩm Viscozyme L từ 0 (mẫu
đối chứng) đến 1.0% v/w.
Đầu tiên hỗn hợp sơ ri xay và chế phẩm enzyme sẽ đồng thời được xử lý bằng sóng
siêu âm ở cơng suất 5.625 W/mL trong thời gian 90s. Sau đó hỗn hợp này được ủ ở bể
điều nhiệt với nhiệt độ 55oC và thời gian xúc tác enzyme được cố định là 60 phút.
3.2.1.1. Hiệu suất thu hồi chất chiết
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm hemicellulase đến hiệu suất thu hồi chất chiết khi xử lý nguyên liệu sơ ri đồng thời bằng sóng siêu âm và enzyme
Với mẫu chỉ xử lý siêu âm, hiệu suất thu hồi chất chiết tăng 7.9% so với mẫu đối chứng không xử lý. Tác động vật lý của sóng siêu âm làm phá vỡ cấu trúc của mô thực vật giúp tạo các kênh dẫn để quá trình thốt dịch bào từ mô quả được dễ dàng hơn, đồng thời làm tăng tốc độ truyền khối và khuếch tán của các phân tử chất tan nằm
trong tế bào ra bên ngồi do đó làm tăng hiệu suất trích ly.
Trong trường hợp kết hợp đồng thời xử lý siêu âm và enzyme, khi nồng độ chế phẩm enzyme tăng từ 0 đến 0.4% (v/w), hiệu suất thu hồi chất chiết tăng mạnh và đạt giá trị
90.7%, tức tăng 33.5% so với mẫu đối chứng không xử lý, và tăng 23.8% so sánh với mẫu chỉ xử lý bằng siêu âm (xen phụ lục D -Bảng D.1 và Hình 3.6).
Nếu tiếp tục tăng nồng độ enzyme lên đến 0.6, 0.8 và 1.0% v/w, hiệu suất thu hồi chất chiết khơng khác biệt có nghĩa theo phân tích thống kê (ở độ tin cậy 95%). Khi xử lý mẫu bằng sóng siêu âm kết hợp đồng thời với enzyme, những tương tác bên trong hệ sẽ diễn ra phức tạp hơn. Việc tăng đáng kể hiệu suất của q trình trích ly có thể bao gồm các yếu tố sau: i). Cấu trúc mô thực vật bị phá vỡ hay bị hư tổn do tác động của sóng siêu âm tạo thành lỗ thủng hoặc các rãnh nứt giúp cho quá trình tiếp xúc và thủy phân của enzyme diễn ra dễ dàng, ii). sóng siêu âm làm tăng tốc độ truyền khối và khuếch tán các cấu tử chất tan từ bên trong tế bào thịt quả ra bên ngồi, iii) sự gia tăng hoạt tính xúc tác của enzyme do tác động của siêu âm (kết quả thí nghiệm 3.1), nhờ vậy mà hiệu suất thu hồi chất chiết sẽ tăng lên đáng kể.
Kết quả của chúng tôi cũng tương tự như một số kết luận rút ra từ các nghiên cứu trước đây. Nghĩa là khi tăng nồng độ chế phẩm enzyme đến một giá trị nào đó thì hiệu
suất thu hồi chất chiết khơng thay đổi theo phân tích thống kê (Dang et al. (2010), Le
et al. (2010), Nguyen et al. (2011)).
Mức độ tăng hiệu suất thu hồi chất chiết trong nghiên cứu này là thấp hơn so với kết quả của Dang et al. (2010) khi xử lý hỗn hợp sơ ri chà đồng thời bằng sóng siêu âm và chế phẩm pectinase (Pectinex Ultra SP-L) (Hiệu suất thu hồi chất chiết tăng 43.2% so với mẫu đối chứng không xử lý), và cao hơn so với kết quả của Nguyen et al. (2011) xử lý hỗn hợp sơ ri chà đồng thời bằng siêu âm và chế phẩm cellulase (Cellulast) (Hiệu suất thu hồi chất chiết chỉ tăng 27.2% so với mẫu đối chứng không xử lý). Do vậy, chúng tôi chọn nồng độ chế phẩm enzyme là 0.4% cho khảo sát tiếp theo.
3.2.1.2. Hàm lượng đường khử
Hình 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm hemicellulase đến hàm lượng đường khử khi xử lý nguyên liệu sơ ri đồng thời bằng sóng siêu âm và enzyme
Tương tự với hiệu suất thu hồi chất chiết, khi nồng độ chế phẩm enzyme thay đổi từ 0 đến 0.4% (v/w), thì hàm lượng đường khử trong dịch trích ly từ 34.41 g/L sẽ tăng đến
45.38g/L, nghĩa là tăng 31.9% so với mẫu đối chứng không xử lý và tăng 22.7% so với mẫu đối chứng chỉ xử lý bằng sóng siêu âm (xem phụ lục D-Bảng D.2).
Sóng siêu âm cắt đứt những mạch dài polysaccharide thành những mạch ngắn hơn và
do đó giải phóng thêm một phần đường khử vào mơi trường trích ly. Điều này đã được
Lomboy et al. (2010) khẳng định khi sử dụng sóng siêu âm trong q trình thủy phân
tinh bột từ bắp để tạo thành các loại đường có khả năng lên men. Hơn nữa, quá trình thủy phân của enzyme cũng được tăng tốc nhờ hỗ trợ của sóng siêu âm, kết quả là hàm
lượng đường khử trong dịch trích cũng tăng đáng kể.
Tuy nhiên mức độ tăng của hàm lượng đường khử không cao như mức độ tăng của
hiệu suất thu hồi chất chiết. Nguyên nhân là do trong chất chiết ngoài hàm lượng
đường cịn có những thành phần khác như acid hữu cơ, xơ hòa tan, các hợp chất
3.2.1.3. Hàm lượng acid tổng
Hình 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm hemicellulase đến hàm lượng acid tổng khi xử lý nguyên liệu sơ ri đồng thời bằng sóng siêu âm và enzyme
Kết quả ở Hình 3.8 và phụ lục-Bảng D.3 cho thấy hàm lượng acid tổng từ 6 g/L sẽ tăng đến 7.65 g/L khi tăng nồng độ chế phẩm enzyme từ 0 đến 0.4% (v/w). Khi so
sánh với mẫu đối chứng khơng xử lý thì mức độ tăng của hàm lượng acid tổng là
27.5%. Nếu tiếp tục tăng nồng độ chế phẩm enzyme, hàm lượng acid tổng trong dịch
trích khơng thay đổi có nghĩa theo kết quả xử lý thống kê (P<0.05).
3.2.1.4. Hàm lượng vitamin C
Hình 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm hemicellulase đến hàm lượng vitamin C khi xử lý nguyên liệu sơ ri đồng thời bằng sóng siêu âm và enzyme
Kết quả thực nghiệm (Hình 3.9 và phụ lục-Bảng D.4) cho thấy trong trường hợp kết hợp xử lý nguyên liệu sơ ri đồng thời bằng sóng siêu âm và chế phẩm enzyme hemicellulase (Viscozyme L) thì dịch quả trích ly được sẽ chứa vitamin C nhiều hơn so với mẫu đối chứng và mẫu chỉ qua xử lý siêu âm. Hàm lượng vitamin C trong dịch
trích sơ ri từ 17.42g/L sẽ tăng lên 18.78g/L khi nồng độ chế phẩm tăng từ 0% đến
0.4% (v/w), và mức độ tăng cao nhất ứng với nồng độ enzyme là 0.4% (hàm lượng vitamin C tăng 12.1% so với mẫu đối chứng không xử lý).
3.2.1.5. Hàm lượng các hợp chất phenolics
Hình 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm hemicellulase đến hàm lượng các hợp chất phenolics khi xử lý nguyên liệu sơ ri đồng thời bằng sóng siêu âm và enzyme
Hàm lượng các hợp chất phenolics trong dịch trích từ 6.84 g/L tăng lên 8.17 g/L khi thay đổi nồng độ chế phẩm enzyme từ 0 đến 1.0%. Hàm lượng các hợp chất phenolics ở nghiệm thức có nồng độ chế phẩm 0.4% (v/w) tăng cao hơn 27.1% so với mẫu đối
chứng không qua xử lý. Nếu tiếp tục tăng nồng độ Viscozyme L, hàm lượng các hợp chất phenolics khơng thay đổi khác biệt theo phân tích thống kê (Hình 3.10 và phụ lục D-Bảng D.5).
Ở tế bào thực vật, các hợp chất phenolics chủ yếu liên kết với polysacchride của thành
tế bào thông qua liên kết hydro hoặc liên kết kỵ nước (Le Bourvellec et al. 2005). Sự
hỗ trợ của siêu âm giúp phá vỡ cấu trúc thành tế bào, bẽ gãy polysaccharide và cùng với quá trình thủy phân hemicellulose do enzyme xúc tác thì các liên kết trong chuỗi polysaccharide bị phá vỡ và các hợp chất phenolics dễ dàng được trích ly vào dịch ép.
3.1.6. Hoạt tính chống oxy hóa
Hình 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm hemicellulase đến hoạt tính chống oxy hóa
khi xử lý nguyên liệu sơ ri đồng thời bằng sóng siêu âm và enzyme
Kết quả thực nghiệm cho thấy khi nồng độ chế phẩm enzyme từ 0 tăng đến 0.4% (v/w) thì hoạt tính chống oxy hóa của dịch trích từ 66.26 sẽ tăng đến 79.66 mmolTEAC/L (theo phương pháp DPPH) và từ 77.02 sẽ tăng đến 98.02 mmolTEAC/L (theo phương pháp ABTS), tức tăng lần lượt 28% (DPPH) và 27.3% (ABTS) khi so sánh với mẫu
đối chứng không qua xử lý. Nếu tiếp tục tăng nồng độ chế phẩm enzyme, hoạt tính oxy
hóa khơng khác biệt có nghĩa theo phân tích thống kê (Phụ lục D-Bảng D.6).
Vitamin C, các hợp chất phenolics được cho là hai thành phần chính ảnh hưởng đến hoạt tính chống oxy hóa trong quả sơ ri (Righetto et al., 2005). Quá trình xử lý nguyên liệu sơ ri đồng thời bằng sóng siêu âm và chế phẩm enzyme đều làm tăng hàm lượng vitamin C và các hợp chất phenolics tổng trong dịch trích sơ ri lần lượt 12.1% và 27.1% nên hoạt tính chống oxy hóa trong dịch trích cũng tăng lên.
3.2.2. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân enzyme
Trong thí nghiệm này, chúng tơi thay đổi thời gian của phản ứng thủy phân enzyme từ
3.2.2.1. Hiệu suất thu hồi chất chiết
Hình 3.12. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân enzyme đến hiệu suất thu hồi chất chiết khi xử lý nguyên liệu sơ ri đồng thời bằng sóng siêu âm và chế phẩm hemicellulase
Khi thời gian thủy phân hemicellulase từ 0 tăng đến 40 phút thì hiệu suất thu hồi chất chiết từ 67.1% sẽ tăng đến 89.5%, tức tăng 33.4% so với mẫu đối chứng không xử lý
và tăng 23.6% so với mẫu chỉ xử lý bằng sóng siêu âm. Nếu tiếp tục tăng thời gian
thủy phân hemicellose lên 60-100 phút thì hiệu suất thu hồi chất chiết khơng khác biệt với nhau theo phân tích thống kê (xem phụ lục D-Bảng D.7).
Khi cho chế phẩm enzyme tiếp xúc với nguyên liệu, cần phải có thời gian để đại phân tử enzyme khuếch tán qua các lớp sơ cấp và thứ cấp ở vách tế bào đễ tạo phức với các phân tử hemicellulose và xúc tác phản ứng thủy phân các phân tử này. Tác động vật lý của sóng siêu âm làm phá hủy thành tế bào thịt quả sơ ri, đẩy nhanh tốc độ truyền
khối, tạo điều kiện cho enzyme dễ dàng tiếp xúc với các hemicellulose trong thành tế bào thịt quả nên thời gian phản ứng thủy phân enzyme được rút ngắn 1.5 lần so sánh với quá trình xử lý hỗn hợp sơ ri xay chỉ sử dụng enzyme (thời gian 60 phút) (Vuong
3.2.2.2. Hàm lượng đường khử
Hình 3.13. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân enzyme đến hàm lượng đường khử khi xử lý nguyên liệu sơ ri đồng thời bằng sóng siêu âm và chế phẩm hemicellulase
Hàm lượng đường khử trong mẫu xử lý tăng cao nhất sau 40 phút thủy phân bởi chế
phẩm hemicellulase, đạt giá trị 44.41g/L và giá trị này tăng 31.6% so với mẫu đối
chứng không xử lý. Nếu tiếp tục tăng thời gian phản ứng thủy phân của enzyme thì
hàm lượng đường khử thu được trong dịch trích là khơng khác biệt có nghĩa theo số
liệu xử lý thống kê (xem phụ lục D-Bảng D.8).
3.2.2.3. Hàm lượng acid tổng
Hình 3.14. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân enzyme đến hàm lượng acid tổng khi xử lý nguyên liệu sơ ri đồng thời bằng sóng siêu âm và chế phẩm hemicellulase