Phụ lục A. Các phương pháp phân tích
A.1. Hoạt tính chế phẩm enzyme (tính theo hoạt tính glucanase, FBG) Hóa chất và cơ chất
- DNS: hòa tan 0.75g DNS trong khoảng 70mL nước cất. Thêm 21.6g kali natri tartarate và 1.4g NaOH. Định mức lên thành 100mL.
- Đệm natri acetate 0.1M: hòa tan 8.2g CH3COONa (13.6g CH3COONa. 3H2O) trong 800mL nước cất. Thêm 5.75 mL CH3COOH. Kiểm tra và hiệu chỉnh pH đến 4.5. Định mức lên thành 1 lít bằng nước cất.
- Dung dịch cơ chất barley beta glucan (0.25g/L): hòa tan bằng cách đun nhẹ 25mg
barley beta glucan trong đệm natri acetate 0.1 M (pH=4.5) và định mức lên đến vạch
100 mL bằng đệm natri acetate.
- Dung dịch glucose stock 2g/L: 0.2g glucose hòa tan bằng nước cất và định mức lên
đến vạch 100mL.
Cách tiến hành
- Ống thí nghiệm với enzyme
+ Cho vào ống nghiệm 0.5mL dung dịch enzyme đã được pha loãng trong đệm
natri acetate.
+ Gia nhiệt lên 55oC trong 15 phút.
+ Thêm 0.75 mL dung dịch cơ chất barley betaglucan 0.25g/L vào. + Ủ ở 55oC trong thời gian 30 phút.
+ Vào cuối thời gian ủ, lấy ống nghiệm ra khỏi bể điều nhiệt và ngừng phản ứng
enzyme bằng cách thêm 3.0mL DNS, lắc đều.
- Mẫu trắng (để hiệu chỉnh máy quang phổ về 0): cho vào ống nghiệm 0.5mL barley
beta-glucan, ủ ở 55oC trong 15 phút. Thêm 0.75 mL đệm natri acetate 0.1 M, ủ ở 55oC trong thời gian 30 phút. Sau đó cho 3 mL DNS vào lắc đều.
- Mẫu enzyme đối chứng: hút 0.5 mL enzyme đã pha loãng trong đệm natri acetate, ủ
55oC trong 30 phút. Thêm 0.75mL barley betaglucan vào ống nghiệm. Lập tức cho 3mL DNS vào ống nghiệm, lắc đều để kết thúc phản ứng. (Chú ý: phải chuẩn bị mẫu
đối chứng riêng cho mỗi sự pha loãng khác nhau).
Màu được đo dựa trên mẫu trắng và trừ giá trị này vào ống phản ứng tương ứng.
- Dựng đường chuẩn glucose
+ Chuẩn bị dung dịch glucose chuẩn theo các nồng độ từ 0; 0.01; 0.05; 0.1; 0.2; 0.25g/L từ dung dịch glucose stock (2g/L).
+ Cách tiến hành giống như đối với mẫu thí nghiệm, nhưng thay 0.75 mL dung dịch barley beta glucan bằng dung dịch glucose chuẩn ở các nồng độ pha loãng khác nhau.
- So màu
Cho tất cả các ống nghiệm vào bể điều nhiệt sôi trong thời gian 5 phút (Chú ý: nên cho tất cả các mẫu thí nghiệm, mẫu enzyme đối chứng, mẫu trắng, mẫu đường chuẩn
glucose vào cùng 1 lúc). Sau đó làm lạnh nhanh tất cả các ống nghiệm này trong bể nước đá lạnh. Thêm 20 mL nước cất, lắc kỹ. Đo độ hấp thu ở bước sóng 540nm.
- Cách tính tốn
+ Xây dựng đường cong tuyến tính của nồng độ glucose chuẩn theo độ hấp thu.
+ Sử dụng đường chuẩn để xác định hàm lượng glucose giải phóng.
+ 1 đơn vị hoạt độ FBG được định nghĩa là lượng enzyme cần thiết để thủy phân
cơ chất barley beta-glucan để phóng thích ra các carbonhydrate có tính khử tương ứng
với 1µmol glucose trong 1 phút ở điều kiện chuẩn.
A.2. Hàm lượng protein hịa tan
Hóa chất - Thuốc thử
- Thuốc nhuộm Bradford: Hòa tan 1mg thuốc nhuộm Coomassive Brilliant Blue vào 50mL etanol 96o, thêm 100mL H3PO4 85%, định mức lên thành 1 lít bằng nước cất. - Dung dịch BSA (Bovine Serum Albumin) 0.1 mg/mL: Hòa tan 0.01g BSA định mức lên thành 100 mL bằng nước cất.
Cách tiến hành
- Dựng đường chuẩn BSA
+ Pha loãng BSA chuẩn 0.1 mg/mL thành các dung dịch có nồng độ 10; 20; 25; 40; 50 µg/mL.
+ Hút 1mL dung dịch BSA ở các độ pha loãng khác nhau cho vào mỗi ống
nghiệm. Thêm vào mỗi ống 5 mL thuốc thử Bradford, lắc đều.
+ Sau 10 phút đo độ hấp thu ở bước sóng 595 nm.
+ Vẽ đồ thị biến thiên của độ hấp thu theo nồng độ BSA.
- Đối với mẫu phân tích
Hút 1 mL mẫu cần phân tích cho vào ống nghiệm. Thêm 5 mL thuốc nhuộm Bradford, lắc đều. Sau 10 phút đo độ hấp thu ở bước sóng 595nm.
- Cách tính tốn: từ đường chuẩn suy ra hàm lượng protein hòa tan trong mẫu cần phân tích.
A.3. Hiệu suất thu hồi chất chiết
- Được tính theo hàm lượng chất khơ hịa tan trong dịch chiết trên tổng hàm lượng chất khô của nguyên liệu.
- Hiệu suất thu hồi chất chiết được tính theo cơng thức:
2 2 1 1 100 m C m C Trong đó:
: hiệu suất thu hồi chất chiết, % m1 : khối lượng nguyên liệu, g
m2 : khối lượng dịch trích ly thu được sau khi ly tâm, g C1 : hàm lượng chất khô trong nguyên liệu, %.
A.4. Hàm lượng đường khử
Hóa chất - Thuốc thử
- Thuốc thử 3,5-dinitrosalicylic acid
+ Hòa tan 1g DNS (C7H4N2O7) và 1.6g NaOH trong khoảng 60 – 70mL nước cất.
Sau đó cho 30g Kali Natri Tartrate (C4H4O6KNa.4H2O) vào hỗn hợp trên và khuấy cho tan hoàn tồn.
+ Chuyển dung dịch trên bào bình định mức 100mL và định mức đến vạch.
+ Dung dịch sau khi pha được bảo quản trong chai thủy tinh màu ở điều kiện lạnh (6 – 80C), dùng tốt nhất trong 15 ngày.
- Dung dịch đường chuẩn
Dung dịch đường chuẩn là dung dịch chứa hỗn hợp glucose và fructose với tỉ lệ 1:1 (w/w), có nồng độ là 2g/l.
Cách tiến hành
- Dựng đường chuẩn
+ Chuẩn bị các dung dịch đường chuẩn theo các nồng độ pha loãng khác nhau: 0.2; 0.4; 0.6; 0.8; 1.0 g/L từ dung dịch đường chuẩn 2g/L.
+ Cho 3 mL các dung dịch đường chuẩn này vào mỗi ống nghiệm. + Thêm vào mỗi ống nghiệm 1 mL thuốc thử DNS, lắc đều.
+ Đậy kín miệng ống nghiệm bằng nút cao su sạch.
+ Cho tất cả các ống nghiệm này vào bể điều nhiệt sôi trong thời gian 5 phút. + Làm lạnh nhanh các ống nghiệm trên trong bể nước đá lạnh.
+ Thêm 10 mL nước cất vào mỗi ống nghiệm và lắc đều cho đến khi dung dịch khơng cịn phân lớp.
+ Đo độ hấp thu ở bước sóng 540nm.
- Mẫu trắng (để hiệu chỉnh máy quang phổ về 0): hút 3 mL nước cất cho vào
ống nghiệm. Cho 1 mL thuốc thử vào lắc đều và tiến hành các bước tiếp theo như trên.
- Đối với mẫu thí nghiệm
+ Pha loãng mẫu sao cho nồng độ đường khử trong mẫu 2 g/L
+ Hút 3 mL mẫu đã pha loãng vào ống nghiệm, thêm 1 mL thuốc thử DNS vào, lắc đều.
+ Tiến hành các bước tương tự như trên.
+ Từ đồ thị đường cong chuẩn sẽ xác định được nồng độ đường khử có trong mẫu cần phân tích.
A.5. Hàm lượng acid tổng
Hóa chất - Thuốc thử
- Thuốc thử phenolphthalein 1%: hòa tan 1 g phenolphthalein trong 100 mL cồn 96o. - Ống chuẩn NaOH 0.1 N: hịa tan tồn bộ NaOH trong ống chuẩn trong nước cất và định mức lên đến vạch 1 L.
Cách tiến hành
Chuẩn độ 25 mL mẫu đã pha loãng bằng dung dịch NaOH 0.1 N với phenolphtalein làm chất chỉ thị đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 30s. Ghi nhận lại thể tích
NaOH 0.1 N đã sử dụng.
- Cách tính tốn:
Hàm lượng acid tổng (tính theo tartaric acid) (g/L) = (VNaOH* Ktartaric* hệ số pha loãng * 1000) / Vmẫu pha loãng
Với
VNaOH: thể tích NaOH 0.1 N dùng để chuẩn độ (mL) Ktartaric = 0.0075
Vmẫu pha loãng = 25 mL.
A.6. Hàm lượng các hợp chất phenolics
Hóa chất - Thuốc thử - Thuôc thử Folin-Ciocalteu
- Dung dịch Na2CO3 20%: hòa tan 20 g Na2CO3 với nước cất và định mức lên đến vạch 100 mL.
- Dung dịch acid gallic stock 1000 ppm: hòa tan 0.1g acid gallic trong nước và định mức lên đến vạch 100 mL.
Cách tiến hành
- Dựng đường chuẩn
+ Chuẩn bị các dung dịch acid gallic chuẩn có nồng độ (mgGAE/L) 20; 40; 50; 80; 100 ppm từ dung dịch acid gallic stock 1000 ppm.
+ Cho 40 µL các dung dịch acid gallic chuẩn vào ống nghiệm. + Thêm 200 µL thuốc thử Folin-Ciocalteu vào, lắc đều.
+ Sau khoảng 5 - 8 phút, thêm 600 µL dung dịch Na2CO3 20% và 3.16 mL nước cất vào ống nghiệm, lắc đều.
+ Đặt các ống nghiệm vào bể điều nhiệt ở nhiệt độ 40oC trong thời gian 30 phút. + Mẫu trắng (dùng để hiệu chỉnh máy quang phổ về 0): thực hiện tương tự như
trên nhưng thay bằng 40 µL nước cất. + Đo độ hấp thu ở bước sóng 760 nm.
+ Dựng đường chuẩn của độ hấp thu A theo nồng độ acid gallic chuẩn (mgGAE/L)
- Đối với mẫu thí nghiệm
+ Cho 40 µL mẫu đã pha lỗng vào ống nghiệm. Các bước tiếp theo thực hiện tương tự như trên. Sau đó tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng 760 nm.
+ Từ đồ thị đường chuẩn ta xác định được hàm lượng các hợp chất phenolics có trong mẫu phân tích.
A.7. Hàm lượng vitamin C
- Đệm phosphate: hòa tan 6.5g KH2PO4 với khoảng 900 mL nước cất 2 lần, điều chỉnh
pH đến giá trị 2.8 bằng H3PO4 đặc 85% và định mức lên đến vạch 1L bằng nước cất 2 lần. Sau đó lọc qua màng lọc đường kính 0.45µm.
- Methanol loại dùng để chạy HPLC.
- Pha động: trộn dung dịch đệm phosphate và methanol theo tỷ lệ methanol : đệm là 1:9, đem lọc qua màng lọc 0.45µm sau đó tiếp tục lọc qua màng 0.1 µm. Động sau lọc đem đi xử lý siêu âm để bài khí.
- Dung dịch L (+) Ascorbic acid stock 1000 ppm được chuẩn bị từ ống chuẩn.
Thiết bị
Hệ thống HPLC (Shimazu, Nhật Bản) gồm bơm LC 10AS, đầu dò quang phổ SPD- 6AV, máy ghi Chromatopac CR 6A, cột ET 250/8/4 Nucleosil® 120-5 C18 thuộc loại cột sắc kí lỏng pha đảo cịn gọi là cột ODS hay RP-18.
Cách tiến hành
- Xây dựng đường chuẩn
+ Chuẩn bị các dung dịch L (+) Ascorbic acid chuẩn ở các nồng độ 20; 40; 60; 80; 100 ppm. Các dung dịch này phải được lọc quan đầu lọc 0.2 µm trước khi đem phân tích.
+ Tiến hành phân tích HPLC, bước sóng hấp thu 245 nm.
+ Dựng đường chuẩn diện tích peak theo nồng độ L (+) Ascorbic acid. - Đối với mẫu thí nghiệm
+ Mẫu được pha loãng với nước theo tỷ lệ thích hợp và được lọc qua đầu lọc
0.2 µm trước khi đem phân tích.
+ Tiến hành phân tích HPLC, bước sóng hấp thu 245 nm. + Dựa vào đường chuẩn tính tốn lượng vitamin C trong mẫu
A.8. Hoạt tính chống oxy hóa A.8.1. Phương pháp ABTS Hóa chất
- Hịa tan 0.096g ABTS trong nước cất và định mức lên đến vạch 25 mL (nồng độ
- Hòa tan 0.017g K2S2O8 trong nước cất và định mức lên đến vạch 25 mL (nồng độ
2.45mM) (ddB)
- Trộn ddA và ddB theo tỉ lệ 1:1 về thể tích, để ở nhiệt độ phịng, trong bóng tối từ 12- 16giờ (Dung dịch Stock).
- Pha loãng dd stock bằng ethanol để đạt độ hấp thu 0.7±0.02 ở 734nm (dd C). Lưu ý: ddC phải được chuẩn bị mới cho mỗi phép thử.
Cách tiến hành
- Dựng đường chuẩn
+ Pha dung dịch chuẩn Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2- carboxylic acid) trong ethanol ở các nồng độ 0; 25; 50; 100; 200; 250, 400 µM.
+ Cho 200µL Trolox chuẩn vào 5700 µL ddC. + Để ở nhiệt độ phịng trong bóng tối 1 phút. + Đo độ hấp thu ở 734nm.
+ Dựng đường chuẩn phần trăm ức chế theo nồng độ Trolox. - Đối với mẫu thí nghiệm
+ Pha lỗng mẫu trong nước cất sao cho độ giảm hấp thu lọt vào trong đường chuẩn.
+ Thêm 200µL mẫu đã pha lỗng vào 5700 µL ddC. + Đo độ hấp thu ở 734nm.
+ Mẫu blank được chuẩn bị bằng cách thay mẫu bằng 200 µL nước cất. - Tính kết quả
- Dựa vào đường chuẩn để tính tốn đương lượng mol Trolox.
- Kết quả được biểu diễn theo đương lượng mol Trolox/ thể tích dịch quả (µmolTEAC/L dịch quả).
A.8.2. Phương pháp DPPH Hóa chất
- Hịa tan DPPH trong methanol tới nồng độ 0.1 mM (ddD) (0.012g DPPH trong 100 mL methanol)
- Pha loãng ddD bằng methanol để đạt độ hấp thu 1.1±0.02 ở 515nm (ddE). Lưu ý: ddE phải được chuẩn bị mới cho mỗi phép thử.
Cách tiến hành
- Dựng đường chuẩn
+ Pha dung dịch chuẩn Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-
carboxylic acid)bằng methanol để có các nồng độ 0; 25; 50; 100; 200; 250, 400 µM. + Thêm 200µL Trolox chuẩn vào 5700 µL ddE.
+ Để ở nhiệt độ phịng trong bóng tối 20 phút. + Đo độ hấp thu ở 515nm.
+ Dựng đường chuẩn phần trăm ức chế theo nồng độ Trolox.
- Đối với mẫu thí nghiệm
+ Pha lỗng mẫu trong nước cất sao cho độ giảm hấp thu lọt vào trong đường chuẩn.
+ Thêm 200µL mẫu đã pha lỗng vào 5700 µL ddE. + Đo độ hấp thu ở 515nm.
+ Mẫu blank được chuẩn bị bằng cách thay mẫu bằng 200 µL nước cất.
- Tính tốn
+ Dựa vào đường chuẩn để tính tốn đương lượng mol Trolox.
+ Kết quả được biểu diễn theo đương lượng mol Trolox/ thể tích dịch quả (µmolTEAC/L dịch quả).