Khảo sát quá trình xử lý sơ ri nguyên liệu đồng thời bằng
sóng siêu âm và enzyme
Ảnh hưởng của
nồng độ chế phẩm enzyme
Ảnh hưởng của
thời gian thủy phân enzyme
Tối ưu hóa bằng quy hoạch thực
nghiệm
Nội dung nghiên cứu
So sánh hiệu quả các phương pháp xử lý nguyên liệu sơ ri Hiệu suất thu hồi chất chiết Hàm lượng đường khử Hàm lượng acid tổng Hàm lượng vitamin C Hàm lượng các hợp chất phenolic Hoạt tính chống oxy hóa HÀM MỤC TIÊU
Ảnh hưởng của quá trình xử lý siêu âm đến hoạt tính của chế phẩm hemicellulase
Ảnh hưởng của
nồng độ protein hòa tan của chế
phẩm Ảnh hưởng
của công suất siêu âm
Ảnh hưởng của
thời gian siêu âm
HÀM MỤC TIÊU
Hoạt tính chế phẩm hemicellulase
Thuyết minh nghiên cứu
2.2.1. Ảnh hưởng của q trình xử lý siêu âm đến hoạt tính của chế phẩm hemicellulase
- Mục đích: đánh giá tác động của sóng siêu âm đối với hoạt tính chế phẩm
hemicellulase (Viscozyme L) từ đó xác định qui luật biến đổi hoạt tính của
hemicellulase do sóng siêu âm gây ra.
Chế phẩm enzyme pha loãng được chuẩn bị trong đệm natri acetate 0.1 M (pH=4.5).
2.2.1.1. Ảnh hưởng của công suất siêu âm
1. Thông số khảo sát Giá trị
Công suất siêu âm 3.75; 5.625; 7.5; 9.375; 11.25; 13.125 W/mL
2. Thông số cố định
Thời gian siêu âm 60 s
V mẫu đem xử lý siêu âm 40 mL
pH 4.5
Nồng độ protein hòa tan 0.33 mg/mL
Hàm mục tiêu: hoạt tính enzyme hemicellulase.
Mẫu đối chứng là mẫu chế phẩm enzyme mà không qua xử lý siêu âm.
2.2.1.2. Ảnh hưởng của thời gian xử lý siêu âm đến hoạt tính enzyme hemicellulase
1. Thông số khảo sát Giá trị
Thời gian siêu âm 30; 60; 90; 120; 150; 180 s
2. Thông số cố định
Công suất siêu âm Chọn kết quả thí nghiệm 2.2.1.1
V mẫu đem xử lý siêu âm 40 mL
pH 4.5
Nồng độ enzyme 0.33 mg/mL
Hàm mục tiêu: hoạt tính enzyme hemicellulase.
2.2.1.3. Ảnh hưởng của nồng độ protein hịa tan của chế phẩm
1. Thơng số khảo sát Giá trị
Nồng độ protein hòa tan trong chế
phẩm trước khi siêu âm 0.11, 0.22, 0.33, 0.44, 0.54 mg/mL
2. Thông số cố định
Thời gian siêu âm Kết quả thí nghiệm 2.2.1.2
V mẫu xử lý siêu âm 40 mL
pH 4.5
Công suất siêu âm Kết quả thí nghiệm 2.2.1.1
Hàm mục tiêu: hoạt tính riêng của chế phẩm hemicellulase.
Mẫu đối chứng là mẫu chế phẩm enzyme không qua xử lý siêu âm ở nồng độ tương ứng.
2.2.2. Khảo sát quá trình xử lý sơ ri nguyên liệu đồng thời bằng sóng siêu âm và enzyme
- Mục đích: xác định hiệu quả của việc xử lý nguyên liệu sơ ri đồng thời bằng sóng siêu âm và chế phẩm hemicellulase (Viscozyme L).
- Chuẩn bị mẫu nguyên liệu sơ ri: Sơ ri sau q trình chà, được pha lỗng với nước ở tỷ lệ nước: nguyên liệu (2:1) (Dang et al., 2010), tiến hành hiệu chỉnh pH của hỗn hợp này về giá trị 4.5. Cho mẫu vào mỗi cốc và khối lượng mẫu trong mỗi cốc là 40g. Sau
đó bổ sung chế phẩm Viscozyme L với hàm lượng thay đổi tùy theo từng nghiệm thức.
- Tiến hành xử lý mẫu đồng thời bằng sóng siêu âm và chế phẩm hemicellulase (điều kiện xử lý siêu âm là kết quả của thí nghiệm 2.2.1.1 và 2.2.1.2). Hỗn hợp sau quá trình xử lý, được ủ ở bể điều nhiệt (nhiệt độ 55oC) với thời gian thay đổi theo từng nghiệm thức. Kết thúc quá trình ủ, các mẫu được làm lạnh nhanh, tiến hành lọc thô và ly tâm dịch lọc để tách cặn mịn. Dung dịch sau khi ly tâm được sử dụng cho các bước phân tích tiếp theo.
Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần, kết quả được biểu thị bằng giá trị trung bình và xử lý thống kê ANOVA bằng phần mềm Stagraphic XV.I
2.2.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzyme
1. Thông số khảo sát Giá trị
Nồng độ chế phẩm enzyme 0; 0.2; 0.4; 0.6; 0.8 và 1.0% v/w
2. Thông số cố định
Thời gian thủy phân enzyme 60 phút
Nhiệt độ thủy phân enzyme 55oC
Hàm mục tiêu: hiệu suất thu hồi chất chiết, hàm lượng đường khử, hàm lượng acid
tổng, hàm lượng vitamin C, hàm lượng các hợp chất phenolics, hoạt tính chống oxy
hóa.
- Mẫu đối chứng là mẫu hỗn hợp nước: sơ ri (2:1), pH (4.5), không xử lý siêu âm và không xử lý enzyme ở cùng điều kiện nhiệt độ và thời gian với các mẫu thí nghiệm.
2.2.2.2. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân enzyme
1. Thông số khảo sát Giá trị
Thời gian thủy phân enzyme 0; 20; 40; 60; 80; 100 phút
2. Thông số cố định
Nồng độ chế phẩm enzyme Kết quả thí nghiệm 2.2.2.1
Nhiệt độ thủy phân enzyme 55oC
Hàm mục tiêu: hiệu suất thu hồi chất chiết, hàm lượng đường khử, hàm lượng acid
tổng, hàm lượng vitamin C, hàm lượng các hợp chất phenolics, hoạt tính chống oxy hóa.
- Mẫu đối chứng là mẫu hỗn hợp nước: sơ ri (2:1), pH (4.5), không xử lý siêu âm và không xử lý enzyme ở cùng điều kiện nhiệt độ và thời gian với các mẫu thí nghiệm.
2.2.2.3. Tối ưu hóa bằng phương pháp qui hoạch thực nghiệm
Để quá trình xử lý đạt hiệu quả cao hơn nữa, trong phần này, thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp qui hoạch thực nghiệm trực giao hai yếu tố, cấu trúc có tâm với hàm mục tiêu là hiệu suất thu hồi chất chiết, sử dụng phần mềm Mode 5.0.
Nồng độ chế phẩm enzyme và thời gian thủy phân enzyme là hai yếu tố được chọn để
2.2.3. So sánh hiệu quả các phương pháp xử lý nguyên liệu sơ ri
Mục đích: đánh giá hiệu quả các phương phán xử lý nguyên liệu sơ ri đến hiệu suất thu hồi chất chiết và chất lượng của dịch chiết sơ ri thu được.
Chúng tôi tiến hành 6 phương án xử lý sơ ri nguyên liệu:
+ Phương án 1: mẫu sơ ri đối chứng không xử lý siêu âm và enzyme (mẫu C).
+ Phương án 2: mẫu sơ ri được qua xử lý siêu âm (công suất siêu âm 5.625 W/mL,
thời gian siêu âm là 90s - kết quả thí nghiệm 2.2.1.1 và 2.2.1.2 (chế độ siêu âm làm
tăng hoạt tính enzyme) (Mẫu U1).
+ Phương án 3: mẫu sơ ri được qua xử lý siêu âm (công suất 3.75 W/g, thời gian siêu
âm là 100s, 40oC) - kết quả tối ưu của Dang et al., 2010 (Mẫu U2).
+ Phương án 4: mẫu sơ ri được xử lý bằng chế phẩm hemicellulase (nồng độ chế phẩm
enzyme 0.8% v/w, thời gian phản ứng thủy phân enzyme 70.79 phút) - kết quả tối ưu của Vuong et al. (2011) (Mẫu Eopt).
+ Phương án 5: mẫu sơ ri được xử lý đồng thời bằng sóng siêu âm và chế phẩm
hemicellulase (chế độ siêu âm- phương án 2, nồng độ chế phẩm enzyme 0.6% v/w,
thời gian phản ứng thủy phân 52 phút) (Mẫu UECopt).
+ Phương án 6: mẫu sơ ri được xử lý lần lượt bằng sóng siêu âm và chế phẩm
hemicellulase (chế độ siêu âm- phương án 3, nồng độ chế phẩm enzyme 0.6% v/w,
thời gian phản ứng thủy phân 69.48 phút) kết quả tối ưu trong khảo sát của Vuong et al.
(2011) (Mẫu UEopt).
Hàm mục tiêu: hiệu suất thu hồi chất chiết, hàm lượng đường khử, hàm lượng acid
tổng, hàm lượng vitamin C, hàm lượng các hợp chất phenolics, hoạt tính chống oxy hóa.
2.3. Phương pháp phân tích
2.3.1. Hoạt tính chế phẩm enzyme
Nguyên tắc: Xác định hàm lượng đường khử sinh ra sau khi enzyme xúc tác phản ứng
thủy phân trên cơ chất beta-glucan có nguồn gốc từ đại mạch. Hàm lượng đường khử
đường khử và DNS ở bước sóng 540nm (Ghose, 1987 và Alexander V. Gusakov, 2011).
1 đơn vị hoạt độ FBG được định nghĩa là lượng enzyme cần thiết để thủy phân cơ chất
beta-glucan có nguồn gốc từ đại mạch (barley beta glucan) để phóng thích ra các
carbonhydrate có tính khử tương ứng với 1 µmol glucose trong 1 phút ở điều kiện
chuẩn.
2.3.2. Nồng độ protein hòa tan
Nguyên tắc: Phương pháp dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc
nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein. Trong dung dịch mang
tính acid, khi chưa kết hợp với protein thì thuốc nhuộm có bước sóng hấp thu cực đại ở
465 nm; khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bước sóng 595 nm.
Đo độ hấp thu của mẫu ở bước sóng 595 nm, dựa vào đồ thị đường chuẩn sẽ tính được hàm lượng protein hịa tan trong mẫu cần phân tích (Bradford, 1976)
2.3.3. Hiệu suất thu hồi chất chiết
Nguyên tắc: dựa trên tỷ lệ phần trăm hàm lượng chất khơ hịa tan trong dịch chiết đối
với tổng hàm lượng chất khô của nguyên liệu ban đầu (Le et al., 2010).
2.3.4. Hàm lượng đường khử
Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng tạo màu giữa đường khử với với thuốc thử 3,5-
dinitrosalicylic acid (thuốc thử DNS). DNS có màu vàng trong dung dịch kiềm sẽ bị khử thành acid 3-amino-5-nitrosalicylic có màu đỏ cam.
NO2 OH COOH NO2 3C6H12O6 + + 4NaOH NH2 OH COONa NO2 3C5H11COONa + 3H 2O
- Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. Đo độ hấp thu ở bước sóng 540 nm, dựa vào đồ thị đường chuẩn
của glucose và fructose (tỷ lệ 1:1), suy ra được nồng độ đường khử trong mẫu phân tích (Miller, 1959).
2.3.5. Hàm lượng acid tổng
Xác định bằng phương pháp chuẩn độ bằng NaOH 0.1 N với phenolphtalein làm chất
chỉ thị (Theo AOAC, 1984).
2.3.6. Hàm lượng các hợp chất phenolics
Nguyên tắc: các hợp chất phenolics bị oxy hóa bởi thuốc thử Folin-Ciocalteu tạo
thành hợp chất có màu xanh. Độ đậm của màu tỉ lệ thuận với nồng độ phenolic có
trong mẫu. Đo độ hấp thu ở bước sóng 760 nm, dựa vào đồ thị đường chuẩn của acid garlic, suy ra nồng độ các hợp chất phenolics có trong mẫu phân tích (Singleton V.L.,
1999).
2.3.7. Hàm lượng vitamin C
Nguyên tắc: pha động sẽ lôi kéo các thành phần L(+)ascorbic acid ra khỏi cột. Khi đi
vào đầu dò đã được cài ở bước sóng thích hợp 245 nm, đầu dị được nối với máy ghi
và chuyển các tín hiệu nhận được thành các peak. Diện tích các peak sẽ đặc trưng cho nồng độ của L(+)ascorbic cần phân tích. Dựa vào đường chuẩn sẽ suy ra nồng độ vitamin C trong mẫu ban đầu (Tran Bich Lam et al., 2006).
2.3.8. Hoạt tính chống oxy hóa
2.3.8.1. Phương pháp DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)
Nguyên tắc: DPPH có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong methanol tinh khiết.
Dung dịch gốc tự do DPPH● trong methanol có màu tím. Khi DPPH● phản ứng với chất có khả năng cho nguyên tử H, nó sẽ chuyển về dạng khử có màu vàng nhạt (màu của nhóm picryl) (Brand-William et al., 1995).
Mức độ giảm độ màu của dung dịch gốc tự do DPPH● tỉ lệ thuận với khả năng
ức chế sự oxi hóa trong một phạm vi nhất định, được đo bằng máy quang phổ so màu ở bước sóng 515 nm. Dựa trên sự giảm độ màu của dung dịch chứa gốc tự do DPPH●
trong methanol ta có thể suy ra phần trăm ức chế sự oxi hóa.
Dựng đường chuẩn phần trăm ức chế sự oxi hóa theo nồng độ Trolox trong methanol tinh khiết, dựa vào đường chuẩn này để suy ra hoạt tính chống oxy hóa của mẫu nghiên cứu.
2.3.8.2. ABTS (2,2’-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid))
Nguyên tắc: Gốc ABTS● có màu xanh trong khi ABTS khơng có màu. Các hợp chất có hoạt tính chống oxi hóa trong mẫu nghiên cứu sẽ cung cấp electron để khử gốc ABTS● thành ABTS. Mức độ giảm độ màu của dung dịch gốc tự do ABTS● tỉ lệ thuận với khả năng ức chế sự oxi hóa trong một phạm vi nhất định, được đo bằng máy quang phổ so màu ở bước sóng 734 nm.
Dựng đường chuẩn phần trăm ức chế sự oxi hóa theo nồng độ Trolox trong ethanol tinh khiết, dựa vào đường chuẩn này để suy ra hoạt tính chống oxy hóa của mẫu nghiên cứu (Roberta et al., 1999).
2.4. Cơng thức tính tốn
Hiệu suất thu hồi chất chiết được tính theo cơng thức:
2 2 1 1 100 m C m C Trong đó:
: hiệu suất thu hồi chất chiết, % m1 : khối lượng nguyên liệu, g
C1 : hàm lượng chất khô trong nguyên liệu, %.
C2 : hàm lượng chất khô trong dịch trích ly sau khi ly tâm, % .
2.5. Phương pháp xử lý số liệu
- Các thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần. Kết quả được trình bày bằng giá trị trung bình ± SD.
- Sử dụng phần mềm Statgraphic XV.I để phân tích thống kê số liệu thí nghiệm và
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Ảnh hưởng của quá trình xử lý siêu âm đến hoạt tính của chế phẩm hemicellulase (Viscozyme L) (Viscozyme L)
3.1.1. Ảnh hưởng của công suất siêu âm
Trong thí nghiệm này, cơng suất siêu âm thay đổi từ 0 đến 13.125 W/mL chế phẩm
enzyme đã pha loãng.
Các mẫu enzyme được pha loãng trong đệm natri acetae 0.1 M để tạo ra các mẫu có
cùng một giá trị nồng độ protein hòa tan là 0.33 mg/mLrồi được đem xử lý siêu âm với thời gian 60s.