a, b, c: phân tử đường D-glucopyranose (phân nhánh tại vị trí α-1,6 với gốc D-xylopyranose). d: phân tử đường D-glucopyranose không phân nhánh
Galacto(gluco)mannan
- Galactomannans và galactoglucomannans tạo thành nhóm thứ hai phổ biến trong cấu trúc hemicellulose hiện diện ở thành tế bào thực vật.
- Mạch chính của chúng gồm các nhóm D-mannose nối kết với nhau bằng liên kết β- 1,4. Mạch bên của chúng gồm các phân tử đường D-galactose liên kết với D-mannose
ở mạch chính bằng liên kết α-1,6 (Hình 1.6). 4 4 4 4 4 a b c d
Hình 1.6. Sơ đồ mơ hình cấu tạo của galactomannan
Riêng đối với galacto(gluco)mannan, ngồi các phân tử D-mannose liên kết với nhau,
các phân tử này cũng liên kết với phân tử D-glucose tại vị trí β-1,4 tạo thành ở mạch
chính của nó.
Galacto(gluco)mannan gồm hai loại: loại tan được trong nước và loại khơng tan trong
nước (Hình 1.7). Galactoglucomannan hòa tan được trong nước có hàm lượng
galactose cao hơn galactoglucomannan khơng hịa tan được trong nước, ngoài ra
chúng cịn chứa các nhóm acetyl gắn với chuổi mạch chính (Timell T. E. 1967). Và
khoảng 20 đến 30% các nhóm glucose và/ hoặc mannose ở khung chính bị ester hóa
với các nhóm acetyl ở vị trí C-2 hoặc C-3 (Lindberg B. et al., 1973).
Hình 1.7. Sơ đồ mơ hình cấu tạo của hai loại galacto(gluco)mannan
1.2.2. Hoạt động của hệ enzyme hemicellulase
- Dựa vào hoạt động phân cắt, các enzyme hemicellulase có thể được chia thành 2
nhóm (Brigham S. J. et al., 1996):
Endo acting enzyme: thủy phân liên kết ở bên trong chuỗi
polysaccharide, khó xúc tác phản ứng khi cơ chất là các oligomer mạch ngắn
(mức độ polymer hóa DP<3).
Exo acting enzyme: thủy phân liên kết từ đầu khử (ví dụ enzyme β-D-
glucuronidase (EC 3.2.1.31)) hoặc đầu không khử của phân tử polysaccharide (ví dụ enzyme β-D-glucosidase (EC 3.2.1.21)) .
1.2.3. Hệ enzyme hemicellulase
Do cơ chất hemicellulose khá đa dạng và có cấu tạo phức tạp nên để thủy phân hồn
tồn phân tử này địi hỏi sự phối hợp hoạt động của nhiều enzyme, chẳng hạn như để thủy phân hồn tồn galacto(gluco)mannan thì cần có các enzyme như β-mannanase và β-manosidase; để thủy phân xylan thì cần có các enzyme như endoxylanase và β-
xylosidase; để thủy phân hồn tồn xyloglucan thì cần có các enzyme như β-glucanase và β-glucosidase...
Tuy nhiên, trong giới hạn luận văn này, chúng tôi sẽ trình bày enzyme thủy phân chính có trong chế phẩm enzyme Viscozyme L (endo-glucanase) mà chúng tôi được sử dụng. Tùy vào vị trí liên kết bị phân cắt mà các enzyme endo-beta-glucanase được xếp vào các nhóm có số EC khác nhau (Bảng 1.2)
Bảng 1.2. Phân loại các enzyme endo-beta-glucanase
EC Tên enzyme Tên khác Cơ chế xúc tác
EC 3.2.1.4 Endo 1,4-β-D- glucanase
Thủy phân liên kết β-1→4-glucosidic của
các cellulose vô định hình, các β-1,3;1,4-
glucan và các β-1,4-glucan phân nhánh
nhiều (ví dụ như tinh bột me (tamarind)).
EC 3.2.1.6 Endo-1,3(4)-β- glucanase
Laminarinase; Laminaranase
Thủy phân liên kết β-1→3 hoặc β-1→4
trong phân tử β-D-glucan khi nhóm glucose nằm trong liên kết bị thủy phân có nhóm thế ở vị trí C-3. EC 3.2.1.39 glucan endo-1,3- β-D-glucosidase Endo-1,3- β- glucanase; hoặc Laminarinase
Thủy phân liên kết β-1→3 trong phân tử 1→ 3-β-D-glucan.
Lưu ý: Hoạt động phân cắt rất hạn chế đối
với các cơ chất chứa hỗn hợp liên kết (1,3- 1,4-)-β-D-glucan.
EC 3.2.1.73 Licheninase Endo-beta-1,3- 1,4 glucanase; hoặc
Licheninase
- Thủy phân liên kết β-1,4- glucosidic trong các phân tử β-glucan có chứa cả liên kết β-
1,3; và β-1,4
- Lưu ý: nó chỉ cắt liên kết β-1,4 liền kề với liên kết β-1,3; đồng thời enzyme này cũng
không hoạt động trên những β-1,3-glucan mạch thẳng hoặc các β-D-glucan chỉ chứa
liên kết 1,3 hoặc 1,4. EC 3.2.1.75 Endo-1,6- β-D- glucanase glucan endo- 1,6-β- glucosidase
Thủy phân liên kết β-1,6-glucosidic trong phân tử (1→6)-β-D-glucans
Các enzyme beta-glucanase có thể được tổng hợp từ nhiều nguồn khác nhau trong tự nhiên,
trong đó nguồn gốc chủ yếu là từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn…). Nấm mốc là
một trong những đối tượng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp endo-beta-glucanase mạnh nhất. Một số nấm mốc thuộc các chi Aspergillus đã được nghiên cứu là có khả năng sản sinh ra các enzyme glucanase nội bào và ngoại bào mạnh như: Aspergillus niger, Aspergillus flavus,
Aspergillus fumigatus, Aspergillus terreus (Ronald P. de Vries và Jaap Visser, 2001). Tuy
nhiên các enzyme được sinh tổng hợp từ các chi Aspergillus khác nhau cũng sẽ có các đặc tính vật lý khác nhau .
Hình 1.8. Liên kết β-1,3-1,4 trong phân tử barley beta glucan
Hình 1.9. Mơ hình các liên kết β-1→3 và β-1→4 trong chuỗi mạch chính của phân tử beta glucan và vị trí cắt của một số enzyme endo-betaglucanse
1.2.4. Ứng dụng chế phẩm hemicellulase trong chế biến nước quả
Một số các enzyme thủy phân polysaccharide trong thành tế bào của mô quả như
pectinase, cellulase và hemicellulase được nghiên cứu và ứng dụng trong quá trình thu nhận dịch quả khơng những giúp giải quyết những khó khăn do q trình lọc gây ra mà cịn giúp cải thiện chất lượng dịch quả sau trích ly (Thomas Schäfer et al., 2007). Nhìn chung, trong cơng nghiệp chế biến nước quả, các chế phẩm hemicellulase được sử dụng ít phổ biến hơn khi so sánh với các chế phẩm enzyme pectinase (do đặc tính
Liên kết β-(1→4)
Liên kết β-(1→3)
Liên kết β-(1→3)
Liên kết β-(1→4)
Vị trí thủy phân của Licheninase
Vị trí thủy phân của Endo 1,4-β-D-glucanase
thành tế bào của quả chủ yếu là pectin như đã trình bày ở trên) (Kashyap D.R., 2000). Tuy nhiên, một số nghiên cứu cũng cho thấy hemicellulase cũng có nhiều tiềm năng trong q trình trích ly trong ngành cơng nghiệp sản xuất nước quả.
Ting Sun et al. (2007) sử dụng chế phẩm hemicellulase (Viscozyme) trong sản xuất
nước măng tây. Kết quả cho thấy với hàm lượng enzyme sử dụng 1% (w/w) ở nhiệt độ 37oC, trong 1 giờ xử lý đầu tiên hiệu suất thu hồi chất chiết tăng 68.6% so sánh với
mẫu đối chứng không xử lý và sau đó khơng thay đổi đáng kể. Hơn nữa hoạt tính
chống oxy hóa trong dịch trích nước măng tây cũng cao hơn 6 lần so với mẫu đối chứng sau 8h xử lý. Trong một nghiên cứu khác, Ting Sun et al. (2005) thấy rằng việc xử lý bằng chế phẩm Viscozyme giúp làm giảm 50% hàm lượng rutin trong nước
măng tây sau 2h xử lý và giảm đến 85% hàm lượng rutin sau 8h xử lý; đồng thời giúp làm tăng hàm lượng quercetin trong nước măng tây (mức độ tăng của quercetin tương ứng với sự giảm hàm lượng rutin).
Nghiên cứu của Yoo-Mi Park và Joogkee Kim (1998) sử dụng 11 loại enzyme thương
mại để thủy phân thành tế bào quả lê trong sản xuất nước quả lê và thấy rằng 4 loại chế phẩm enzyme cho hiệu suất trích ly cao nhất là Pectinex Ultra SP-L, Cytolase M102, Viscozyme L và Rapidase liq(+). Hiệu suất trích ly đạt khoảng 88% đến 91%;
đồng thời độ đục của dung dịch nước quả sau trích ly giảm đáng kể khi được xử lý
bằng chế phẩm Pectinex Ultra SP-L, Viscozyme L.
Trong một nghiên cứu khác của Zheng et al. (2009) khi sử dụng các chế phẩm enzyme
như cellulase (Cellulast 1.5L), hemicellulase (Viscozyme L), pectinase (Pectinex 5XL)
trong quá trình trích ly các thành phần phenolics từ quả táo. Kết quả cho thấy chế phẩm hemicellulase (Viscozyme L) cho hiệu quả trích ly là cao nhất khi so sánh với các chế phẩm enzyme khác. Với tỷ lệ enzyme/cơ chất là 0.02 (v/w), quá trình thủy
phân được thực hiện ở pH 3.7, nhiệt độ 50oC trong thời gian 12h thì hàm lượng các hợp chất phenolics, đường khử và hiệu suất trích ly tăng lần lượt 3; 1.5 và 2 lần so với mẫu đối chứng.
1.3. Tổng quan về sóng siêu âm
1.3.1. Một số khái niệm và tính chất của sóng siêu âm 1.3.1.1. Khái niệm
- Sóng siêu âm là các sóng cơ học ở tần số cao hơn ngưỡng nghe của con người (>16
kHz).
Hình 1.10. Các dãy tần số của sóng
- Sóng siêu âm có thể được chia thành các dãy tần số khỏc nhau (Demirdoăven & Baysal, 2009).
+ Siêu âm tần số thấp (16-100 kHz): mức năng lượng thường trong phạm vi 10-1000
W/cm2, chúng được ứng dụng để làm biến đổi các đặc tính vật lý, hóa học của thực
phẩm.
+ Siêu âm tần số cao (100kHz-1MHz) năng lượng thấp (thường < 1 W/cm2): được ứng
dụng trong điều khiển qui trình và xác định các tính chất hóa lý của nguyên thực
phẩm.
+ Siêu âm chẩn đoán (1-10MHz): được dùng để đo hệ số tốc độ và hấp thụ của sóng
trong mơi trường, thường được dùng trong scan y học, phân tích hóa học.
1.3.1.2. Các hiệu ứng khi sóng siêu âm truyền qua hệ chất lỏng
Có hai hiện tượng quan trọng trong quá trình siêu âm truyền qua hệ chất lỏng, đó là hiện tượng sủi bong bóng và hiện tượng vỡ bong bóng.
Khi truyền sóng siêu âm truyền trong mơi trường lỏng, các phần tử trong mơi trường trải qua các chu trình nén và dãn (Mason et al., 2005). Khi năng lượng đủ cao, chu kỳ
dãn có thể vượt qua lực hấp dẫn của các phân tử chất lỏng và hình thành các lỗ hổng khí từ các phân tử khí tồn tại trong lòng chất lỏng hay còn được gọi là các bong bóng khí. Những bong bóng này phân bố trong chất lỏng, lớn lên theo thời gian ở một vài chu kỳ đến một kích thước tới hạn cho đến khi chúng trở nên không ổn định và vỡ đi
Hình 1.11. Q trình sủi bóng và vỡ bóng khi siêu âm truyền qua mơi trường lỏng
Q trình vỡ bong bóng dẫn đến việc tích lũy năng lượng tại các điểm, tạo ra nhiệt độ cực cao (5000 K) và áp suất cực lớn (1000 atm), điều này tạo nên một lực cắt lớn và gây nên sự hỗn loạn trong vùng có bong bóng khí. Sự kết hợp của các yếu tố (áp suất, nhiệt độ và sự chuyển động hỗn loạn) gây nên nhiều tác động trong hệ chất lỏng mà sóng siêu âm truyền qua.
Một hiện tượng khác - kết quả từ sự thay đổi kích thước bong bóng và sự vỡ bóng - là sự xuất hiện của các vi dòng (micro-streaming), kết hợp với lực cắt mạnh làm thay đổi
các đặc tính mơi trường (Suslick, 1988).
Một hiệu ứng quan trọng là liên kết trong các phân tử nước có thể bị bẽ gãy tạo ra các gốc tự do hoạt động mạnh (cịn gọi là hiện tượng hóa âm). Các gốc tự do này có thể tham gia phản ứng và làm biến đổi các phân tử khác (Riesz và Kondo, 1992).
Điều này mở ra một loạt các cơ chế liên quan trong quá trình xử lý bằng siêu âm, nó
có thể gây ra hiệu ứng vật lý và hóa học với nhiều ứng dụng tiềm năng trong ngành công nghiệp thực phẩm như q trình trích ly, đồng hóa/ nhũ hóa, phá bọt , kết tinh...
1.3.2. Các nhân tố ảnh hưởng đến q trình siêu âm
Tần số
Các sóng siêu âm có tần số lớn thì có mức năng lượng được truyền đi nhỏ và ngược lại.
(Mason và Lorimer, 2002).
Công suất
Công suất siêu âm tăng làm tăng mức năng lượng được truyền vào môi trường, năng lượng này được chuyển thành nhiều dạng, cuối cùng là nhiệt năng (Mason và Lorimer,
2002).
Nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng đến tính chất hóa lý của mơi trường truyền sóng, do đó ảnh hưởng
đến q trình truyền năng lượng của sóng siêu âm vào mơi trường (Mason và Lorimer,
2002).
Thời gian
Thời gian siêu âm càng dài, các biến đổi của sóng siêu âm càng sâu sắc (Mason và Lorimer, 2002).
1.3.3. Sóng siêu âm và q trình trích ly
Cơ chế sóng siêu âm hỗ trợ q trình trích ly
- Sóng siêu âm hỗ trợ tốt cho q trình trích ly có thể được giải thích dựa trên các hiệu
ứng khi sóng siêu âm truyền qua một hệ chất lỏng: đó là hiện tượng sủi bong bóng và
hiện tượng vỡ bong bóng. Nó gây ra các hiệu ứng vật lý và hóa học và các hiệu ứng
này có tác động tích cực đến hiệu quả của q trình trích ly.
- Nhìn chung, cơ chế của sóng siêu âm giúp làm tăng khả năng trích ly so với qui trình trích ly truyền thống là dựa trên những nguyên nhân sau:
+ Sóng siêu âm tạo ra một áp lực lớn xuyên qua dung môi và tác động đến tế bào vật liệu: làm bẽ gãy thành tế bào hoặc tạo các rãnh nứt hoặc các lỗ hổng ở bề mặt tế bào giúp q trình phóng thích các cấu tử chất tan vào mơi trường trích ly được dễ dàng và nhanh chóng (Jian-Bing et al., 2006).
+ Tăng khả năng truyền khối tới bề mặt phân cách, tăng gia tốc độ khuếch tán
nội phân tử và ngoại phân tử đồng thời giúp dịch chuyển các chất cần trích ly ra ngồi
mơi trường trích ly (Jian-Bing et al., 2006).
Ứng dụng siêu âm trong q trình trích ly
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng sóng siêu âm giúp cải thiện đáng kể hiệu quả trích ly và được tóm tắt ở Bảng 1.3
Bảng 1.3. Tóm tắt một số kết quả siêu âm hỗ trợ q trình trích ly
Hợp chất
trích ly Q trình siêu âm Dung môi Hiệu quả Tác giả
Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ thảo mộc Bể siêu âm có khuấy trộn, tần số từ 20-2400 kHz Nước và ethanol Hiệu suất trích ly tăng đến 34% trong
điều kiện khuấy
trộn. Vinatoru (2001) Saponin trong nhân sâm Bể siêu âm, 38.5kHz Nước, methanol và n-butanol Tốc độ trích ly gia tăng 3 lần. Wu et al. (2001) Rutin từ cây Chinese Scholar Bể siêu âm, tần số 20kHz Nước và methanol Gia tăng đến 20% trong 30 phút. Paniwynk et al. (2001) Isoflavones đậu nành Bể siêu âm, tần số 24kHz Nước và dung môi ethanol
Hiệu quả trích ly gia
tăng đến 15%.
Rostagno et al. (2003)
Dầu quả hạnh Bể siêu âm, tần số 20kHz
CO2 siêu tới hạn
Hiệu suất trích ly
tăng 30% so với mẫu đối chứng.
Riera et al. (2004)
Carnosic acid từ
cây hương thảo
Bể siêu âm, tần số 20 và 40kHz Butanol và ethyl acetate Rút ngắn thời gian trích ly Albu et al. (2004) Geniposide từ quả dành dành
Siêu âm ở cường
độ 0.15W.cm-2
Ethanol Hiệu suất trích ly của Geniposide tăng 16.5%, so sánh với qui trình tĩnh sử dụng 40 mL dung môi/ g nguyên liệu
Jian-Bing et al. (2006)
Polysaccharide từ cơm nhãn sấy khô
Năng lượng siêu âm 680W, thời gian 4.5 phút, tỷ
lệ nước/nguyên
liệu 25 mL/g
Nước Hiệu suất trích ly
polysaccharide đạt 4.5%. Kui Zhong, Quiang Wang (2010)
1.3.4. Sóng siêu âm và hoạt tính enzyme
Hầu hết các nghiên cứu về tác động của sóng siêu âm đến hoạt tính enzyme đều cho
thấy rằng, ở cường độ cao sóng siêu âm có thể gây cắt mạch, cắt đứt liên kết một số nhóm chức ở trung tâm hoạt động hoặc làm phá hủy các bậc cấu trúc của enzyme dẫn
đến sự vơ hoạt một phần hay hồn tồn hoạt tính của enzyme (Mawson et al., 2011).
Tuy nhiên trong một số trường hợp, sóng siêu âm có thể làm tăng hoạt tính enzyme. Các tác động hóa học và vật lý của sóng siêu âm để làm vơ hoạt hay hoạt hóa những enzyme khác nhau cũng phụ thuộc vào trạng thái của enzyme và điều kiện xử lý
(Huihua Huang, 2008).
1.3.4.1. Sóng siêu âm làm giảm hoạt tính enzyme
Sóng siêu âm có thể gây ra sự bất hoạt ở nhiều enzyme. Sự vơ hoạt enzyme bởi sóng siêu âm chủ yếu là do các ảnh hưởng vật lý và hóa học của hiện tượng sủi bong bóng. Quá trình vỡ bóng được đồng hành với việc gia tăng cục bộ của áp suất (1000 MPa) và nhiệt độ (5000oK). Thêm vào đó, sóng siêu âm làm các bong bóng khí chuyển động,
tạo ra các sóng dừng gây nên lực cắt mạnh và các vi dòng ngay trong chất lỏng. Khi đó, sóng siêu âm có thể bẻ gãy các liên kết hydro trong chuỗi polypeptide, dẫn đến làm
thay đổi cấu trúc bậc 2 và bậc 3 của phân tử protein. Với sự thay đổi cấu trúc bậc 2 và
bậc 3, hoạt tính sinh học của enzyme thường bị mất đi (Mawson et al., 2011).
1.3.4.2. Sóng siêu âm làm tăng hoạt tính enzyme
Sóng siêu âm khi xử lý ở chế độ thích hợp có thể làm tăng hoạt tính enzyme (Choi &
Kim, 1994). Đó là do sóng siêu âm có thể ảnh hưởng lên cấu trúc của enzyme, tác động đến trung tâm hoạt động của enzyme và sự thay đổi này diễn ra theo chiều hướng