CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.3.1. Phương pháp định lượng progesteron bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao
Để định lượng các mẫu, sử dụng phương pháp định lượng PGT bằng HPLC. Để đảm bảo độ tin cậy của phương pháp định lượng, tiến hành kiểm tra phương pháp định lượng dựa trên 2 tiêu chí: độ lặp lại và độ tuyến tính.
a) Điều kiện chạy sắc kí
Qua tài liệu tham khảo [10], điều kiện chạy sắc kí như sau:
- Thiết bị: Hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC Shimadzu
- Cột sắc kí Aligent C18 kích thước cột 250 x 4,6 mm, kích thước hạt nhồi 5 µm
- Pha động là hỗn hợp methanol : nước cất (80:20), siêu âm 20 phút - Tốc độ dòng 1 ml/phút
- Nhiệt độ: 250C - Thể tích tiêm: 20 µl
- Detector UV phát hiện ở bước sóng 254 nm. b) Xử lý mẫu
Mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,0300 g PGT hịa tan trong 50,00 ml dung mơi methanol sau đó bổ sung nước từ từ đến vừa đủ 100 ml, siêu âm 10 phút thu được dung dịch S1 có nồng độ chính xác khoảng 300 µg/ml.
Lần lượt hút một lượng mẫu từ dung dịch S1 pha loãng bằng pha động thành các dung dịch từ S2 đến S6 tương ứng với nồng độ: 6, 12, 30, 60, 150 µg/ml.
Dãy dung dịch chuẩn từ S1 đến S6 được lọc qua màng lọc 0,45 µm. c) Phương pháp đánh giá các chỉ tiêu
Để đảm bảo độ tin cậy của phương pháp HPLC trong định lượng PGT. Phương pháp xử lý và điều kiện chạy sắc kí được đánh giá thơng qua các tiêu chí sau:
➢ Độ tuyến tính
Tiến hành chạy sắc kí dãy dung dịch chuẩn từ S1 đến S6 trong điều kiện đã chọn.
Xây dựng đường chuẩn biểu diễn mối liên hệ giữa diện tích pic và nồng độ PGT với hệ số tương quan R2 ≥ 0,99.
18
Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần một dung dịch chuẩn PGT 30 µg/ml với điều kiện sắc kí ở trên. Ghi lại các giá trị về thời gian lưu và diện tích pic. Độ lặp lại của phương pháp được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích pic ≤ 2%.