CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.3.3. Phương pháp đánh giá sinh khả dụng in vivo trên động vật thí nghiệm
a) Thiết kế mơ hình đánh giá sinh khả dụng trên thỏ
Qua tham khảo tài liệu [9], tiến hành đánh giá sinh khả dụng của công thức organogel tối ưu dùng qua da trên động vật thí nghiệm và so sánh với chế phẩm thị trường dùng đường uống theo mơ hình sau:
- Chuẩn bị động vật thí nghiệm: 9 con thỏ trắng giống đực trưởng thành (4 – 6 tháng tuổi) có khối lượng khoảng 2 kg, được ni trong phịng ni động vật của bộ môn Dược lực trường Đại học Dược Hà Nội với điều kiện dinh dưỡng đầy đủ và cho nhịn ăn 12 giờ trước khi tiến hành thí nghiệm.
- Chuẩn bị mẫu thuốc:
• Mẫu organogel chứa eutecti của progesteron và menthol được bào chế theo các bước đã trình bày ở mục 2.3.1.2. với tỉ lệ thành phần sau khi đã tối ưu trên phần mềm MODDE 12.0
• Chế phẩm đối chiếu: viên nang dùng đường uống Utrogestan® 100mg. - Mơ hình đánh giá sinh khả dụng: 9 con thỏ đực chia 2 nhóm (3 – 5 con/nhóm):
• Nhóm 1 (n=4): Bơi một lượng chính xác organogel tương ứng với liều 10 mg/kg cân nặng trên vùng da 3cm x 5cm trên lưng thỏ đã được cạo lơng sạch sẽ
• Nhóm 2 (n=5): Cho thỏ uống lượng dịch nhân của viên đối chứng tương ứng với liều 10 mg/kg cân nặng, sử dụng ống sonde đưa thuốc vào dạ dày thỏ.
20
• Nhóm 1: sau khi bơi mẫu thuốc trên da lưng thỏ 3, 4, 6, 8, 10, 12, 26, 29, 32 giờ, tiến hành hút 2 ml máu thỏ cho vào ống có tráng EDTA
• Nhóm 2: sau khi cho uống 5, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240, 360 phút, tiến hành hút 2ml máu thỏ cho vào ống có tráng EDTA
• Ly tâm mẫu máu với tốc độ 5000 vòng/phút trong 10 phút. Thu huyết tương, bảo quản ở nhiệt độ -10ºC trước khi đưa đi phân tích LC-MS/MS.
b) Phương pháp chiết QuEChERS
Hút chính xác 500 µl huyết tương cho vào ống ly tâm 2 ml.
Thêm 25 µl dung dịch nội chuẩn đồng vị progesteron-2,2,4,6,6,17α,21,21,21-d9 (PGT-d9) 1µg/ml và 475 µl acetonitril. Tiến hành lắc xốy trong vịng 1 phút để tạo hỗn hợp đồng nhất.
Tiếp tục thêm 0,2 g MgSO4 và 0,05 g NaCl. Lắc xoáy trong vịng 1 phút sau đó ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút trong vòng 10 phút. Hút lớp dịch lỏng trên cùng đưa đi định lượng bằng phương pháp LC-MS/MS [7].
c) Phương pháp phân tích trong huyết tương bằng LC-MS/MS
Sử dụng chất nội chuẩn đánh dấu đồng vị: progesteron-2,2,4,6,6,17α,21,21,21- d9 (PGT-d9). Tiến hành định lượng bằng phương pháp LC-MS/MS với các điều kiện HPLC như sau:
- Cột sắc kí: Agilent Eclipse XD8-C18 (3,0 x 150 mm), kích thước hạt nhồi 3,5 µm.
- Thể tích tiêm: 10 µl. - Tốc độ dịng: 0,5 ml/phút.
21
Bảng 2.4. Chương trình dung mơi của phương pháp sắc kí lỏng khối phổ
Thời gian (phút)
Pha động
ACN (%) dd acid formic
0,1% (%) 0,00 30,00 70,00 1,80 30,00 70,00 2,00 95,00 5,00 7,50 95,00 5,00 7,51 30,00 70,00 10,00 30,00 70,00
d) Thẩm tra phương pháp định lượng bằng LC-MS/MS
Phương pháp định lượng PGT trong huyết tương thỏ bằng LC-MS/MS đã được thẩm định dựa trên các tiêu chí: tính chọn lọc, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), khoảng tuyến tính và đường chuẩn, độ lặp lại và thu hồi trong tài liệu [9].
• Tính tuyến tính và đường chuẩn
Để thẩm tra lại độ tuyến tính của phương pháp, khố luận thực hiện phân tích các dung dịch huyết tương trắng thêm chuẩn PGT có nồng độ thay đổi từ 2,0 đến 2000,0 ng/ml và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ.
Phương pháp xây dựng đường chuẩn định lượng PGT trong huyết tương thỏ tiến hành như sau:
Chuẩn bị dãy dung dịch huyết tương trắng thêm chuẩn PGT với các nồng độ 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 1500, 2000 ng/ml có thêm 50 ng/ml nội chuẩn PGT-d9.
Dịch chiết huyết tương trắng được chuẩn bị bằng cách chiết 0,5 ml acetonitril với 0,5 ml huyết tương thỏ tại thời điểm 0 phút. Sau khi hỗn hợp được đồng nhất bằng cách lắc xoáy 1 phút, tiếp tục thêm 0,2 g MgSO4 và 0,05 g NaCl và lắc xoáy 1 phút. Hút lớp dịch trên để đem pha dãy dung dịch chuẩn. Tiến hành định lượng dãy dung dịch chuẩn bằng phương pháp LC-MS/MS.
Xây dựng đường phụ thuộc giữa nồng độ chất chuẩn PGT và tỷ lệ diện tích pic chuẩn trên diện tích pic nội chuẩn [7].
• Tính thích hợp của hệ thống
Để đánh giá tính thích hợp hệ thống của phương pháp phân tích, khố luận tiến hành tiêm lặp lại trên nền huyết tương trắng thêm chuẩn ở nồng độ 1000 ng/ml (n = 6). Tính tốn giá trị RSD (độ lệch chuẩn tương đối) của diện tích pic và độ thu hồi. Các giá trị cần đạt yêu cầu của AOAC (Phụ lục 4).
22
Sử dụng phương pháp phân tích dược động học khơng dựa trên mơ hình ngăn với trợ giúp của NCA (Non-compartmental analysis) trong phần mềm Phoenix 8 để tính tốn các thơng số dược động học:
- AUC0-∞ (area under curve): diện tích dưới đường cong biểu diễn nồng độ - thời gian từ thời điểm 0 đến ∞
- MRT (Mean residence time): thời gian lưu trú trung bình của PGT trong huyết tương
- λz: hằng số thải trừ (độ dốc của đường thẳng biểu diễn logarit nồng độ - thời gian tại pha thải trừ)
- Cmax: nồng độ PGT cực đại trong huyết tương
- Tmax: thời gian để PGT đạt nồng độ cực đại trong huyết tương.