Thời gian (phút)
Pha động
ACN (%) dd acid formic
0,1% (%) 0,00 30,00 70,00 1,80 30,00 70,00 2,00 95,00 5,00 7,50 95,00 5,00 7,51 30,00 70,00 10,00 30,00 70,00
d) Thẩm tra phương pháp định lượng bằng LC-MS/MS
Phương pháp định lượng PGT trong huyết tương thỏ bằng LC-MS/MS đã được thẩm định dựa trên các tiêu chí: tính chọn lọc, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), khoảng tuyến tính và đường chuẩn, độ lặp lại và thu hồi trong tài liệu [9].
• Tính tuyến tính và đường chuẩn
Để thẩm tra lại độ tuyến tính của phương pháp, khố luận thực hiện phân tích các dung dịch huyết tương trắng thêm chuẩn PGT có nồng độ thay đổi từ 2,0 đến 2000,0 ng/ml và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ.
Phương pháp xây dựng đường chuẩn định lượng PGT trong huyết tương thỏ tiến hành như sau:
Chuẩn bị dãy dung dịch huyết tương trắng thêm chuẩn PGT với các nồng độ 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 1500, 2000 ng/ml có thêm 50 ng/ml nội chuẩn PGT-d9.
Dịch chiết huyết tương trắng được chuẩn bị bằng cách chiết 0,5 ml acetonitril với 0,5 ml huyết tương thỏ tại thời điểm 0 phút. Sau khi hỗn hợp được đồng nhất bằng cách lắc xoáy 1 phút, tiếp tục thêm 0,2 g MgSO4 và 0,05 g NaCl và lắc xoáy 1 phút. Hút lớp dịch trên để đem pha dãy dung dịch chuẩn. Tiến hành định lượng dãy dung dịch chuẩn bằng phương pháp LC-MS/MS.
Xây dựng đường phụ thuộc giữa nồng độ chất chuẩn PGT và tỷ lệ diện tích pic chuẩn trên diện tích pic nội chuẩn [7].
• Tính thích hợp của hệ thống
Để đánh giá tính thích hợp hệ thống của phương pháp phân tích, khố luận tiến hành tiêm lặp lại trên nền huyết tương trắng thêm chuẩn ở nồng độ 1000 ng/ml (n = 6). Tính tốn giá trị RSD (độ lệch chuẩn tương đối) của diện tích pic và độ thu hồi. Các giá trị cần đạt yêu cầu của AOAC (Phụ lục 4).
22
Sử dụng phương pháp phân tích dược động học khơng dựa trên mơ hình ngăn với trợ giúp của NCA (Non-compartmental analysis) trong phần mềm Phoenix 8 để tính tốn các thơng số dược động học:
- AUC0-∞ (area under curve): diện tích dưới đường cong biểu diễn nồng độ - thời gian từ thời điểm 0 đến ∞
- MRT (Mean residence time): thời gian lưu trú trung bình của PGT trong huyết tương
- λz: hằng số thải trừ (độ dốc của đường thẳng biểu diễn logarit nồng độ - thời gian tại pha thải trừ)
- Cmax: nồng độ PGT cực đại trong huyết tương
- Tmax: thời gian để PGT đạt nồng độ cực đại trong huyết tương.
2.3.3. Phương pháp tính tốn và xử lí kết quả
• Các số liệu thống kê xử lý kết quả bằng phần mềm Microsoft Excel 2010
• Thiết kế thí nghiệm sử dụng phần mềm MODDE 12.0 (Umetrics Inc, USA)
• Tính tốn nồng độ PGT trong huyết tương nhờ phần mềm Agilent MassHunter Quantitative Analysis (for QQQ)
23
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Đánh giá phương pháp định lượng progesteron 3.1. Đánh giá phương pháp định lượng progesteron
3.1.1. Đánh giá phương pháp định lượng progesteron bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC cao HPLC
3.1.1.1. Tính tuyến tính
Để định lượng nồng độ PGT trong các mẫu đánh giá khả năng giải phóng in vitro của hệ eutecti – organogel, các khóa luận trước đã tiến hành xây dựng phương
pháp định lượng PGT sử dụng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC. Tiến hành khảo sát dãy dung dịch chuẩn PGT có nồng độ trong khoảng từ 6,0 µg/ml đến 150,0 µg/ml theo mục 2.3.3.1. Đường chuẩn và phương trình biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ PGT được thể hiện trong bảng 3.1 và hình 3.1: