ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.4.Phương pháp đánh giá sự sai khác di truyền của các dòng đột biến bằng chỉ thị phân tử SSR
chỉ thị phân tử SSR
Để tiến hành phân tích và đánh giá sự đa dạng di truyền của các giống hoa cẩm chướng ở mức độ phân tử, DNA của 7 mẫu hoa cẩm chướng được nhân bản bằng phương pháp PCR với 20 mồi SSR (Smulders et al., 2003; Tetsuya et al.,
2009). Các sản phẩm được điện di trên gel agarose 3,5%.
2.4.4.1. Phương pháp chiết tách DNA
Trong thí nghiệm này chúng tôi chiết tách DNA tổng số của các mẫu cẩm chướng dựa theo phương pháp của Obara and Kako (1998) có cải tiến. Quy trình tách chiết như sau:
B1: Mô lá được cắt nhỏ, nghiền 0,1 g mẫu lá trong Nitơ lỏng bằng chày cối sứ thành dạng bột mịn (dung dịch trở lên đồng nhất), cho vào ống eppendorf 1,5 ml
B2: Bổ sung 800 µl đệm chiết CTAB buffer có nhiệt độ 600C và 60 µl dung dịch SDS 10% vào mẫu rồi cho vào máy vortex đảo đều.
B3: Ủ mẫu trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 650C trong 30 phút, lấy ra để nguội ở nhiệt độ phòng.
B4: Bổ sung chloroform (tỷ lệ 1:1) về thể tích so với dịch mẫu sau đó đảo đều. B4: Ly tâm 12.000 vòng/phút ở nhiệt độ 40C trong 15 phút. Hút dịch nổi phía trên sang ống eppendorf mới, bỏ cặn.
B5: Bổ sung 2,0 µl RNAse (nồng độ 10 µg/ml) vào dung dịch thu được, ủ ở nhiệt độ 370C trong 1 giờ.
12000 vòng/phút ở nhiệt độ 40C trong 10 phút để thu tủa.
B7: Loại bỏ dịch nổi phía trên, rửa kết tủa DNA bằng Ethanol 70% 2 lần, rồi làm khô DNA ở nhiệt độ phòng.
B8: Hòa tan DNA bằng đệm TE. Kiểm tra nồng độ và chất lượng DNA bằng cách điện di 5 µl dung dịch DNA trên gel agarose 1% với thang nồng độ DNA chuẩn là 25 µg. 2.4.4.2. Phương pháp PCR – SSR Thành phần của hỗn hợp phản ứng SSR-PCR bao gồm: + Taq buffer 1X: 1,5 µl + MgCl2 2mM: 1,0 µl + dNTP 10µM: 0,15 µl + Primer F (1µM): 1,0 µl + Primer R (1µM): 1,0 µl + DNA khuôn: 0,2 µl + Taq-polymeraza: 0,15 µl + H2O: 10,0 µl Tổng: 15 µl
Phản ứng PCR được thực hiện qua nhiều chu kì, mỗi chu kì gồm 3 giai đoạn: + Giai đoạn biến tính: thực hiện biến tính ở nhiệt độ 950C trong thời gian 1 phút. Ở giai đoạn biến tính đầu tiên là 950C trong thời gian 5 phút; giai đoạn này có thể khác nhau tùy từng loại DNA khuôn.
+ Giai đoạn gắn mồi: được thực hiện ở nhiệt độ 37 - 550C tùy theo từng mồi. Các đoạn mồi sẽ bắt cặp với DNA khuôn mạch đơn ở các vị trí bổ sung.
+ Giai đoạn kéo dài chuỗi: thực hiện ở nhiệt độ 720C trong thời gian 2 phút (thời gian kéo dài chuỗi cũng được điều chỉnh tùy theo từng mồi để có thể thu được các sản phẩm PCR mong muốn). Đối với phản ứng SSR- PCR vì đây là nhiệt
độ tối ưu cho sự hoạt động của enzym Taq - polymeraza. Dưới sự xúc tác của enzym này những đoạn mồi đã bắt cặp với DNA khuôn sẽ được kéo dài về phía 5’ của sợi dùng làm khuôn.
- Tóm tắt chu trình nhiệt cho phản ứng PCR - SSR:
Bước Phản ứng Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ
1 Biến tính 95 5 phút 1
2 Biến tính 95 1 phút
30
3 Bắt cặp mồi Tm 1 phút
4 Kéo dài mạch 72 2 phút
5 Hoàn tất kéo dài 72 5 phút 1
6 Kết thúc phản ứng 4 1
(Tm: nhiệt độ bắt cặp của mồi với DNA khuôn, tùy theo từng mồi trong mỗi phản ứng PCR - SSR).
Điện di trên gel agarose kiểm tra sản phẩm phản ứng PCR: sản phẩm sau phản ứng PCR được điện di trên gel agarose 3,5% để kiểm tra.
2.4.4.3. Phương pháp điện di trên gel agarose Chuẩn bị gel agarose:
B1: Cân agarose cho vào 100ml dung dịch đệm TAE 1X (khối lượng cân tùy theo nồng độ cần), khuấy nhẹ.
B2: Đun trong lò vi sóng để hòa tan hoàn toàn agar. Chú ý không để agar sôi trào ra và phải tan hoàn toàn (không nhìn thấy hạt lợn cợn). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
B3: Chuẩn bị khay đổ gel, lau rửa sạch và lắp sẵn lược.
B4: Để gel nguội bớt xuống nhiệt độ 50 - 600C, cho vào Ethidium bromide, lắc nhẹ cho đều (dung dịch gel có màu hơi hồng).
B5: Đổ gel vào khay. Để trong 30 phút cho gel đông hoàn toàn.
Điện di: Sau khi gel đã đông hoàn toàn, nhẹ nhàng tháo lược ra khỏi bản gel (tránh làm vỡ giếng). Đặt bản gel vào bể chạy điện di. Cài đặt điều kiện chạy điện di: 80V - 120 mA - 75 phút.
Soi gel và chụp ảnh điện di: Soi gel dưới ánh sáng đèn UV, nhận biết sản phẩm khuếch đại dựa vào thang chuẩn DNA 1Kb.
2.4.4.4. Phương pháp phân tích số liệu
Các băng DNA được ghi nhận dựa trên sự có mặt hay vắng mặt của chúng ở các mẫu nghiên cứu theo thang DNA chuẩn (DNAmarker), xuất hiện băng là “1”, không xuất hiện băng là “0’’. Các số liệu này được đưa vào xử lý theo chương trình NTSYSpc 2.1 của Rohlf (2002) để tính ma trận tương đồng giữa các cặp mẫu. Việc tính toán ma trận tương đồng được dựa theo công thức của Nei and Li (1979):
Jij= 2nijni+nj