cẩm chướng
Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2005).
Cơ sở lý luận của phương pháp đó là dựa trên cơ sở tính toàn năng và đặc tính phân hoá và phản phân hoá của tế bào thực vật.
Theo Haberlandt (1902), mỗi tế bào của bất kỳ sinh vật nào cũng đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Đó chính là tính toàn năng của tế bào.
Quá trình phân hóa tế bào là quá trình tế bào hợp tử phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt. Sau đó từ các tế bào phôi sinh chúng tiếp tục biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau. Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành mô chức năng chúng không hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình. Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự phân hóa tế bào. Quá trình phản phân hóa và tái phân hóa tế bào là con đường để có thể tái sinh được cơ thể thực vật nguyên vẹn từ các tế bào, mô chuyên hóa khi nuôi cấy in vitro.
Nuôi cấy mô, tế bào thực vật có thể phục vụ nhiều mục đích khác nhau. Trong lĩnh vực giống cây trồng nó được ứng dụng để làm phong phú vật liệu di truyền cho công tác chọn tạo giống, nhân nhanh và duy trì những giống và các thể có ý nghĩa khoa học, làm sạch bệnh vi rút, phục tráng những giống thoái hoá,... Trong đó, ứng dụng nhân giống vô tính cây trồng là lĩnh vực được quan tâm hơn cả. Vi nhân giống (Micropropagation) hay nhân giống bằng nuôi cấy mô là lĩnh vực ứng dụng có hiệu quả nhất trong công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2005).
pháp nhân giống vô tính truyền thống như giâm, chiết cành hoặc ghép mắt, là có hệ số nhân cao, có thể đạt tới 103 - 1012 lần/năm. Ngoài ra, phương pháp này không phụ thuộc vào điều kiện thời tiết nên có thể tiến hành quanh năm. Đây là phương pháp đặc biệt ưu việt với các loại cây khó nhân giống bằng con đường nhân giống hữu tính, các giống quý hiếm có số lượng giống ban đầu hạn chế mà lại cần nhân nhanh. Phương pháp nhân giống in vitro có thể tạo ra một quần thể đồng nhất với số lượng lớn, cây giống khoẻ mạnh, sạch bệnh, có thể phục tráng một quần thể thực vật có nguy cơ bị diệt vong, có thể trao đổi quốc tế nguồn gen và lưu giữ, bảo quản dưới dạng cây con in vitro. Nó đã được ứng dụng rất có hiệu quả cho rất nhiều loại cây trồng như cây hoa, cây lương thực, cây ăn quả, cây công nghiệp và cây dược liệu,… (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2005).
Việc ứng dụng kỹ thuật nhân giống cây trồng bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro đã mang lại những thành công hết sức to lớn trên hầu hết các loại cây trồng. Theo thống kê, Trung Quốc đã có đến 700 chủng loại thực vật đã được nhân giống bằng cách nuôi cấy mô. Ở nước ta kỹ thuật nhân giống in vitro đã được ứng dụng thành công ở nhiều loài cây hoa như hoa hồng, hoa tường anh, hoa trà, hoa cúc, hoa loa kèn, hoa lan, .... và rất nhiều loài cây ăn quả, cây thuốc.
Ứng dụng nhân giống in vitro đối với cây hoa cẩm chướng cũng đã được rất nhiều tác giả trong và ngoài nước quan tâm nghiên cứu. Các kết quả nghiên cứu cho thấy:
Nhân giống in vitro đối với cây cẩm chướng có thể bằng nhiều phương thức khác nhau như: Nuôi cấy thông qua tái sinh tạo mô sẹo, phương thức này có thể sử dụng nguồn vật liệu từ các bộ phận của cây nhưng phổ biến là sử dụng tái sinh từ lá (Archana and Kothari, 2002; Mehta et al., 2007), tái sinh từ rễ (Seo et al., 2007); Nuôi cấy tạo chồi trực tiếp từ các bộ phận, phương thức này được áp dụng phổ biến trong nhân giống in vitro cho cây hoa cẩm chướng nói riêng và các loài thực vật nói chung. Nguồn vật liệu nuôi cấy có thể sử dụng nhiều cơ quan khác nhau sử dụng chóp rễ, chồi nách, chồi đỉnh, lá, nụ hoa (Archana and Kothari, 2002; Meena et al.,
2006; Bora et al., 2007). Tuy nhiên, chồi đỉnh, chồi nách được sử dụng phổ biến vì chúng là những chồi nguyên thủy (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007) và cho
hệ số nhân chồi cao hơn so với các bộ phận khác (Bora et al., 2007).
Để khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy có thể sử dụng nhiều loại hóa chất khác nhau như hypochlorite calcium (9,0 - 10%) trong 5 - 30 phút, hypochlorite sodium (0,5 - 5,0%) trong 5 - 50 phút, oxy già (3,0 - 12%) trong 5 - 15 phút, chlorua thủy ngân (0,1 - 1,0%) trong 2 - 10 phút, nitrate bạc (1,0%) trong thời gian 5 - 30 phút, … (Gamborg and Philips, 1995). Các kết quả nghiên cứu trên một số giống cẩm chướng cho thấy, đối với cây hoa cẩm chướng sử dụng chlorua thủy ngân nồng độ 0,1% để khử trùng mẫu cấy trong thời gian 5 - 10 phút cho hiệu quả hơn cả (Lê Đức Thảo, 2010).
Môi trường nuôi cấy là cơ sở và là điều kiện cần thiết để đảm bảo cho sự nuôi cấy thành công các tế bào, mô thực vật tách rời. Tùy từng bộ phận, giai đoạn và mục đích nuôi cấy khác nhau mà các môi trường có thành phần khác nhau. Các kết quả nghiên cứu cho thấy, đối với các giống khác nhau, các bộ phận nuôi cấy khác nhau thì môi trường nuôi cấy tối ưu có sự khác nhau (Meena et al., 2006; Esmaiel et al., 2013).
Các nghiên cứu về môi trường tái sinh mô sẹo từ lá cây cẩm chướng cho thấy tùy từng giống khác nhau có thể sử dụng môi trường MS bổ sung 0,5 - 2,0 mg/l α-NAA và 0,5 - 3,0 mg/l BAP hoặc 0,5 - 2,0 mg/l kinetin sẽ cho hiệu quả cao (Archana and Kothari, 2002; Mosquera et al., 2009; Mehta et al., 2007; Sayeed et al., 2011; Esmaiel et al., 2013). Theo Archana and Kothari (2002) khi sử dụng môi trường MS + 3,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l α-AA hoặc 3,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l α-NAA chồi có khả năng hình thành trực tiếp từ mô lá mà không hình thành mô sẹo. Đối với việc tái sinh mô sẹo từ rễ thì việc bổ sung 1,0 mg/l Thidiazuron (TDZ) và 1,0 mg/l α-NAA sẽ cho hiệu quả cao (Seo et al., 2007).
Môi trường tạo chồi thích hợp đối với cây cẩm chướng là MS bổ sung 0,25 - 0,5 mg/l α-NAA + 0,5 - 1,0 mg/l BA hoặc 0,5 - 2,0 mg/l kinetin (Aparna et al., 2004; Mehta et al., 2007; Aamir et al., 2008; Sayeed et al., 2011; Mahdiyeh et al., 2011; Esmaiel et al., 2013). Tuy nhiên việc bổ sung BA hoặc kinetin nồng độ cao trong môi trường nuôi cấy sẽ làm tăng tỷ lệ chồi bị thủy tinh hóa (Mahdiyeh et al.,
Môi trường tạo rễ thích hợp là MS bổ sung 0,5 - 1,0 mg/l IBA; 1,0 mg/l α- NAA hoặc IAA có thể kết hợp với 0,25 - 0,5 g/l than hoạt tính (Aparna et al., 2004; Mehta et al., 2007; Aamir et al., 2008; Sayeed et al., 2011; Mahdiyeh et al., 2011; Esmaiel et al., 2013). Casanova et al. (2008) nghiên cứu ảnh hưởng của lượng agar trong môi trường nuôi cấy cẩm chướng cho thấy khi bổ sung agar trong môi trường nuôi cấy từ 0 - 12 g/l làm giảm dần khả năng sử dụng nước, làm giảm khả năng tái sinh chồi của mẫu. Các chỉ tiêu hàm lượng nước trong chồi, khối lượng tươi, số lượng, kích cỡ của các tế bào và số lượng chồi tái sinh cũng giảm. Do đó, độ ẩm tương đối và nước có sẵn trong môi trường nuôi cấy không chỉ ảnh hưởng đến hình thái mẫu mà còn ảnh hưởng đến các chỉ tiêu sinh lý của chồi.
Có thể sử dụng nhiều loại giá thể để thích ứng cây cẩm chướng in vitro
ngoài vườn ươm như: đất (Bora et al., 2007), cát, cát + đất và cát + trấu hun (Nguyễn Quang Thạch và cs., 1996); cát + đất + phân hữu cơ (1:1:1) (Omid, 2011); trấu hun và hạt perlite (7:3) (Lê Đức Thảo và cs., 2009); cát + phân hữu cơ (1:1) (Nguyễn Thị Kim Lý và cs., 2012). Bên cạnh đó, việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ khí canh để thích ứng cây cẩm chướng in vitro trong điều kiện tự nhiên cũng đã thu được kết quả khả quan (Nguyễn Thị Lý Anh và cs., 2010).
Qua các nghiên cứu nêu trên về nhân giống in vitro cây cẩm chướng có thể kết luận như sau:
- Về bộ phận nuôi cấy: có thể nuôi cấy từ nhiều bộ phận khác nhau: rễ, đỉnh sinh trưởng, đoạn thân, lá. Tuy nhiên mẫu nuôi cấy từ chồi nách phát triển tốt hơn.
- Về phương pháp khử trùng mẫu: Có thể sử dụng nhiều loại hóa chất khử trùng khác nhau, nhưng sử dụng chlorua thủy ngân nồng độ 0,1% để khử trùng mẫu cấy trong thời gian 5 - 10 phút cho hiệu quả cao.
- Về môi trường nuôi cấy: môi trường cơ bản MS với hàm lượng đường từ 2 - 3% được sử dụng phổ biến. Môi trường này sẽ được bổ sung thêm chất điều tiết sinh trưởng thực vật thông dụng như: BA, kinetin, α-NAA và IBA với nồng độ thấp (0,2 - 2 mg/l) ở dạng riêng rẽ hay tổ hợp tùy thuộc vào từng giai đoạn nuôi cấy (tạo mô sẹo, tạo chồi, tạo rễ,…).
- Về giá thể trồng cây in vitro tại vườn ươm: có thể sử dụng nhiều loại giá thể khác nhau, tuy nhiên cây phát triển tốt hơn khi sử dụng giá thể thoáng khí.