Việc xử lý gây tạo đột biến kết hợp nuôi cấy in vitro có thể theo nhiều cách khác nhau, tùy thuộc vào tác nhân gây đột biến, loại cây trồng, bộ phận xử lý và mục đích. Qua tổng hợp các công trình nghiên cứu của các tác giả cho thấy việc gây tạo đột biến kết hợp có thể theo các phương thức sau:
- Xử lý trước khi nuôi cấy in vitro: thường áp dụng đối với xử lý bằng tác nhân vật lý. Cây được trồng vào các chậu, lựa chọn cây sinh trưởng phát triển tốt đem xử lý, có thể xử lý từng bộ phận của cây hoặc toàn cây. Cây được lựa chọn để xử lý đột biến thường là những dòng thích nghi tốt với điều kiện địa phương, chỉ thiếu một vài tính trạng cần thiết nào đó (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007). Các bộ phận của cây sau xử lý được tách ra và đưa vào nuôi cấy in vitro
có thể nuôi cấy không thông qua mô sẹo mà tạo chồi trực tiếp, sau đó chọn lọc các dạng biến dị). Theo Predieri and Virgilio (2007) các chồi in vitro cần được sàng lọc và nhân qua ít nhất 3 thế hệ M1V3 sau đó tạo cây hoàn chỉnh và đưa ra trồng ngoài đồng ruộng theo dõi, phân lập đánh giá để thu thập các thể đột biến có lợi.
Bằng phương pháp này Datta et al. (2005) đã nghiên cứu xử lý đột biến in vitro cho cây hoa cúc bằng chiếu xạ gamma với liều 500 rad. Tác giả đã xử lý trên bốn giống khác nhau (Flirt, Puja, Maghi và Sunil) sau đó đưa vào nuôi cấy in vitro, chọn lọc các dạng biến dị và tái sinh cây hoàn chỉnh và đưa ra trồng ngoài đồng ruộng, tác giả đã phân lập được một số dạng đột biến trong đó có 5 dạng biến đổi về màu sắc, hình thái hoa có triển vọng. Barakat et al. (2010) đã nghiên cứu chiếu xạ tia gamma cho cánh hoa cúc với liều 0,5 Gγ và 1,0 Gγ, chồi tái sinh từ mô sẹo đã tạo ra nhiều dạng màu sắc hoa và dạng cánh hoa khác nhau.
- Xử lý trong nuôi cấy in vitro: phương pháp này có thể áp dụng cho cả hai tác nhân vật lý và hóa học. Theo phương pháp này giống cây trồng cần xử lý được lựa chọn bộ phận đưa vào nuôi cấy mô (có thể nuôi cấy tái sinh mô sẹo nếu xử lý mô sẹo hoặc nuôi cấy tạo chồi nếu xử lý chồi), sau đó xử lý gây tạo đột biến bằng các tác nhân vật lý hoặc hóa học (có thể xử lý riêng rẽ từng tác nhân hoặc xử lý kết hợp cả 2 tác nhân). Bước tiếp theo là phân lập các dạng đột biến sau đó tiến hành nhân qua các thế hệ. Ở giai đoạn này nếu mục đích chọn tạo giống chống chịu người ta thường chọn lọc các dạng đột biến bằng phương pháp chọn lọc có áp lực chọn lọc (chọn lọc tính chịu mặn, tính kháng bệnh, tính chịu nhiệt,…) (Jain, 2010). Sau đó sẽ tạo cây hoàn chỉnh và đưa ra trồng ngoài đồng ruộng để theo dõi đánh giá thu thập các dạng đột biến, lựa chọn các dòng triển vọng đánh giá sự sai khác ở mức độ phân tử bằng marker DNA (Joanna et al., 2012).
Xử lý gây tạo đột biến trong nuôi cấy in vitro là phương pháp được áp dụng phổ biến và đã mang lại rất nhiều thành công trên các đối tượng cây trồng khác nhau (Mohan, 2010). Theo phương pháp này Seetohul et al. (2009)đã nghiên cứu xử lý đột biến in vitro cho cây khoai sọ. Chồi ngọn được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng, sau đó được xử lý chiếu xạ gamma với liều 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 40 và 60 Gγ. Dựa trên đặc điểm hình thái, tác giả phân lập được 44 dạng đột
biến sau đó sử dụng kỹ thuật RADP để đánh giá sự đa dạng di truyền của 11 dạng, kết quả cho thấy giữa chúng có sự đa dạng di truyền cao.
Hình 1.5. Trình tự các bước xử lý đột biến in vitro bằng chiếu xạ
(Nguồn: Novak and Brunner, 1992)
Đào Thị Thanh Bằng và cs. (2007) đã chiếu xạ mô sẹo hoa cúc bằng tia gamma (Co60) ở các liều từ 1 - 15 Krad. Sau khi cây con tái sinh và cấy chuyển 3 lần, cây con được đưa vào môi trường ra rễ. Nhiều thể khảm và đột biến solid đã xuất hiện ở thế hệ M1V4 và đã thu được 3 thể đột biến solid về màu sắc quan trọng đó là hoa màu hồng, hoa màu vàng và hoa có chóp cánh màu xanh.
Suprasanna et al. (2009) đã xử dụng lá non cây mía đưa vào nuôi cấy tạo mô sẹo, sau đó xử lý chiếu xạ với liều 10, 20, 30, 40 và 50 Gγ. Mô sẹo được cấy
chuyển 3 lần để loại bỏ chất phóng xạ và chuyển sang nuôi cấy trong môi trường có bổ sung muối NaCl với nồng độ khác nhau (42,8 - 256,7 mM). Kết quả tác giả đã chọn lọc được 147 cây con có khả năng chịu đựng được nồng độ muối khác nhau. Tác giả đã sử dụng 60 cặp mồi RADP để đánh giá sự đa dạng di truyền giữa các dòng đột biến. Kết quả lựa chọn được 44 dòng có tiềm năng.
Orkun and Sema (2011) đã nghiên cứu sử dụng chồi củ khoai tây đưa vào nuôi cấy in vitro và xử lý chiếu xạ với liều lượng 5, 10 , 15, 20 , 25, 30 và 50 Gγ. Sau đó chọn lọc trên môi trường bổ sung muối NaCl với nồng độ khác nhau. Kết quả tác giả đã chọn lọc được một số dòng đột biến có khả năng chịu mặn.
Muhamad et al. (2013), nghiên cứu xử lý đột biến in vitro cho chồi cây nghệ bằng chiếu xạ gamma với liều lượng 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120 và 140 Gγ. Tác giả đã chọn lọc được 8 dạng đột biến (LP1 - LP8). Sau đó sử dụng mồi RADP để đánh giá sự đa dạng di truyền. Kết quả cho thấy giữa các dòng đột biến có sự đa dạng di truyền cao. Tác giả cũng đã xác định được LD50 là 10 Gγ.
- Xử lý trước và trong nuôi cấy in vitro: Theo cách này chúng ta sẽ trồng cây vào các chậu, lựa chọn cây sinh trưởng phát triển tốt đem xử lý, có thể xử lý từng bộ phận của cây hoặc toàn cây. Các bộ phận của cây sau xử lý được tách ra và đưa vào nuôi cấy in vitro (giai đoạn này có thể nuôi cấy tạo mô sẹo sau đó chọn lọc mô seo tái sinh cây hoặc có thể nuôi cấy không thông qua mô sẹo mà nuôi cấy tạo chồi sau đó chọn lọc các dạng biến dị). Bước tiếp theo tiếp tục xử lý bằng các tác nhân vật lý hoặc hóa học (có thể xử lý riêng rẽ từng tác nhân hoặc xử lý kết hợp cả 2 tác nhân). Sau đó phân lập các dạng đột biến sau đó tiến hành nhân qua các thế hệ. Ở giai đoạn này nếu mục đích chọn tạo giống chống chịu người ta thường chọn lọc các dạng đột biến bằng chọn lọc có áp lực chọn lọc (chọn lọc tính chịu mặn, tính kháng bệnh, tính chịu nhiệt,…). Các chồi sau xử lý được tạo cây hoàn chỉnh và đưa ra trồng ngoài đồng ruộng để theo dõi đánh giá thu thập các dạng đột biến. Lựa chọn các dòng triển vọng đánh giá sự sai khác ở mức độ phân tử bằng marker DNA. Bằng phương pháp này Datta and Chakrabarty (2009) đã xử lý chiếu xạ liều lượng 1,5; 2,0 và 2,5 Krad trên cây hoa cúc đang ra hoa giống Puja, Lilith, Maghi, Purnima và Colchi Bahar. Lựa chọn hoa đột biến khảm đưa
vào nuôi cấy tạo mô sẹo, sau đó tiếp tục xử lý chiếu xạ gamma với liều 0,5 và 1,0 Krad. Mô sẹo được cấy chuyển để tạo cây hoàn chỉnh sau đó trồng ra ngoài vườn, theo dõi đánh giá. Kết quả tác giả đã phân lập được một số dạng hoa biến đổi về màu sắc, cấu trúc hoa, trong đó có một số dạng có tiềm năng.