CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phương pháp nghiêncứu
2.4.2. Các kỹ thuật được sử dụng trong nghiêncứu
2.4.2.1. Kỹ thuật điều tra muỗi Anopheles
- Phương pháp mồi người trong và ngoài nhà trong đêm (MNTN và MNNN)
+ Mục đích: Xác định lồi Anopheles ưa thích đốt người; loài là véc tơ sốt rét; diễn biến véc tơ đốt người trong đêm; véc tơ đốt người trong hay ngoài nhà rẫy, tỷ lệ muỗi đốt người trong so với ngoài nhà.
+ Vị trí thực hiện: Ở trong và ngồi nhà, nơi thường có người dân địa phương sinh hoạt vào ban đêm.
+ Thời gian thực hiện: Từ 18h - 6h sáng hôm sau. Trong mỗi đợt điều tra, thực hiện phương pháp mồi người ngoài nhà trong 4 đêm cho mỗi điểm điều tra.
+ Kỹ thuật: Người mồi muỗi thường mặc quần cộc hoặc vén quần lên để chân ra thu hút muỗi. Người mồi muỗi ngồi yên, chờ cho muỗi đến đốt máu thì soi đèn pin, dùng tuýp bằng thuỷ tinh có thủng hai đầu để bắt. Dùng bông không thấm nước để đậy miệng tuýp. Khoảng 2 - 3 phút bật đèn lên để kiểm tra, không chiếu đèn trực tiếp vào muỗi vì ánh sáng kích thích làm muỗi bay mất. Ghi lại giờ bắt muỗi, nơi bắt muỗi.
+ Mật độ: Con/giờ/người (c/g/n).
- Phương pháp bắt muỗi bằng bẫy đèn CDC trong nhà (BĐTN) và ngồi nhà ban đêm (BĐNN)
+ Mục đích: Nghiên cứu về thành phần loài, sự dao động theo mùa của quần thể Anopheles; mật độ và hoạt động của muỗi Anopheles trong và ngoài nhà; theo dõi tỷ lệ muỗi vào nhà.
+ Thời gian: Cho bẫy đèn hoạt động từ 18h00 - 6h00 sáng hôm sau. Trong mỗi đợt điều tra, treo các bẫy đèn vào 4 đêm cho mỗi điểm điều tra.
+ Vị trí đặt bẫy đèn: Mỗi điểm đặt 4 bẫy đèn gồm: 2 bẫy trong nhà và 2 bẫy ngoài nhà. Dùng bẫy đèn CDC (Centre for Disease Control) bắt muỗi trong nhà. Bẫy đèn ngoài nhà đặt cách xa nhà khoảng 10 - 50 mét. Treo đèn cách mặt đất khoảng 1,8 mét.
+ Mật độ: Con/đèn/đêm (c/đ/đ).
- Phương pháp soi bắt muỗi vách trong và vách ngoài nhà ban đêm (SVT và SVN)
+ Mục đích: Xác định lồi Anopheles có tập tính trú đậu rình đốt người trong nhà; những nơi trú đậu thông thường; mật độ trú đậu trong nhà của các loài muỗi.
+ Thời gian thực hiện: Tiến hành bắt muỗi trú đậu trong nhà từ 19h-23h đêm. Mỗi điểm điều tra tiến hành phương pháp này 2 ngày.
+ Địa điểm: Trong một điểm nghiên cứu chọn 10 nhà để bắt muỗi, vị trí của những nhà được lựa chọn phân bố đều.
+ Mật độ: Con/nhà/đêm (c/n/đ).
- Phương pháp thu thập muỗi chuồng gia súc đêm (SCGS)
+ Mục đích của phương pháp này là xác định thành phần, mật độ các loài Anopheles đốt máu gia súc, cung cấp muỗi cho thử sinh học đánh giá hiệu lực tồn lưu của hóa chất và mức nhạy cảm của muỗi với hóa chất diệt cơn trùng, cung cấp muỗi để ni trong phịng thí nghiệm nhằm phục vụ cho các nghiên cứu khác nhau.
+ Thời gian thu thập muỗi từ 18 giờ tối đến 6 giờ sáng hôm sau.
+ Địa điểm: Bẫy màn dùng gia súc làm mồi được bố trí bên ngồi gần nhà, sát với vị trí gia súc thường ở lại qua đêm. Chọn một con trâu, bị thuần tính của dân địa phương tại điểm nghiên cứu để làm mồi. Trước khi mặt trời lặn, dùng dây thừng cột trâu, bò đã chọn vào chiếc cọc đã đóng cố định xuống đất ở vị trí đặt bẫy. Treo bẫy màn trùm lên con trâu, bò được làm mồi. Khi treo bẫy màn phải để mép dưới (chân màn) cách mặt sàn hoặc mặt đất khoảng 15-20 cm để muỗi có thể bay vào trong màn qua khoảng hở này. Để màn không bị thổi, cần phải cố định chân màn vào những chiếc cọc đã đóng chặt vào mặt đất.
+ Mật độ: Con/giờ (c/g)
- Phương pháp điều tra bọ gậy
+ Mục đích: Xác định thành phần lồi; xác định nơi ưa thích đẻ trứng của muỗi, nơi phát triển giai đoạn trước trưởng thành của loài.
+ Địa điểm thực hiện: Chọn tất cả các thủy vực muỗi có thể đẻ trứng. Các loại ổ nước tiềm tàng gồm có: Ổ nước trong rừng; các vũng, ổ nước nhỏ,
rãnh nước; các dịng suối có cỏ ở bờ và nước chảy chậm. Mỗi đợt điều tra, ở mỗi loại thuỷ vực điều tra 5 điểm, mỗi điểm vớt 20 bát (0,5 lít); ở các thủy vực nhỏ, bắt tất cả bọ gậy có trong thủy vực đó.
+ Thời gian điều tra: Từ 8 giờ - 11 giờ sáng. + Mật độ: tổng số bọ gậy/100 bát (c/b).
2.4.2.2. Kỹ thuật định loại
Định loại muỗi và bọ gậy Anopheles dựa trên đặc điểm hình thái muỗi và bọ gậy theo Bảng định loại muỗi Anopheles ở Việt Nam (2008) của Viện Sốt rét - KST-CT Trung ương [12]. Thực hiện như sau:
- Cho muỗi ra đĩa petri, dùng kim mổ cắm vào ngực muỗi, giữa đơi chân thứ hai, chếch về phía sau cho 2 cánh muỗi xoè ra.
- Quan sát muỗi bằng lúp tay có độ phóng đại 10x, hoặc lúp hai mắt có độ phóng đại 20x sơ bộ nhận xét các đặc điểm sau: muỗi đực hay muỗi cái, Anophelinae hay Culicinae, cánh có điểm trắng đen hay đồng màu, chân có hoa hay đen tuyền, các đốt bàn chân có băng trắng hay khơng có băng trắng. Sau khi có khái niệm chung, dùng lúp tay quan sát chi tiết, so sánh các đặc điểm đó với bảng định loại và xác định lồi.
2.4.2.3. Kỹ thuật mổ muỗi và quan sát buồng trứng
Số muỗi còn sống sẽ được tiến hành mổ và soi buồng trứng để xác định muỗi đã đẻ hay chưa đẻ theo qui trình kỹ thuật của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO,1994) [115], [116] và của Viện Sốt rét-KST-CT Trung ương (2011)
[55].
- Kỹ thuật mổ muỗi
Gây mê muỗi bằng ether hay chloroform, dùng kính lúp định loại muỗi. Dùng kéo cắt chân, cánh, đầu muỗi.
Cho lên lam kính 3 giọt nước muối sinh lý, mỗi giọt cách nhau 1,5 cm. Đưa lam kính vào kính lúp 2 mắt, muỗi được đặt vào giọt nước ở giữa, đầu muỗi hướng về phía bên phải, bụng muỗi hướng về phía người mổ và dùng
kim xé rách một ít kitin ở đốt cuối (đốt 7 và 8). Đặt kim phải lên trên ngực muỗi, kim trái lên đốt cuối cùng và kéo dần kim sang phía trái cho đến khi dạ dày và 2 buồng trứng được lôi ra khỏi bụng muỗi. Vớt xác muỗi ra khỏi lam kính. Tách 2 buồng trứng sang giọt nước bên trái, dạ dày vẫn giữ nguyên ở giọt nước giữa.
- Phương pháp soi buồng trứng để xác định muỗi đã đẻ hay chưa
Sau khi mổ lấy buồng trứng, dùng kim mổ vớt buồng trứng đặt lên giọt nước cất trên một cái lam sạch. Để nước cất khơ tự nhiên. Soi buồng trứng dưới kính hiển vi, độ phóng đại 10x, 40x, muỗi chưa đẻ khí quản của buồng trứng xoắn lại, muỗi đã đẻ khí quản buồng trứng dãn ra.
2.4.2.4. Kỹ thuật ELISA xác định muỗi nhiễm KSTSR
Kỹ thuật ELISA (Thử nghiệm miễn dịch liên kết Enzym - Enzym Linked Immunosorbent Assay) phát hiện ký sinh trùng SR trong cơ thể muỗi (theo Cẩm nang kỹ thuật phòng chống bệnh sốt rét của Viện Sốt rét-KST-CT Trung ương, 2011) [55].
Sau khi thu thập muỗi ở thực địa, số muỗi chết, xác muỗi sau khi mổ được phơi khô, sẽ được bảo quản trong tuýp Eppendorf và cho vào hộp có chứa silicagel sử dụng cho thử nghiệm ELISA để xác định KSTSR trong cơ thể véc tơ sốt rét tại phịng thí nghiệm của Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn.
ELISA dựa trên nguyên lý kết hợp giữa kháng nguyên bề mặt của thoa trùng sốt rét trong muỗi với các kháng thể đơn dịng có gắn các chất oxi hóa để giúp hiện màu. Phản ứng xảy ra có thể tóm tắt như sau: kháng thể + kháng nguyên (từ mẫu vật) + kháng thể có gắn chất oxi hóa + chất hiện màu = màu dương tính.
Các bước tiến hành theo quy trình theo các bước: Đĩa (Plate) thử nghiệm ELISA có 96 giếng (8x12), được phủ bằng 50 microlit kháng thể đơn dòng MAb P.f 2A10, Pv 210, Pv 247, ủ qua đêm ở nhiệt độ phòng. Dung dịch trong giếng được đổ ra, 200 microlit dung dịch blocking buffer (BB) được
cho vào mỗi đĩa, ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Dung dịch trong giếng được đổ ra. Làm khô đĩa. 50 micrôlit dung dịch muỗi nghiền được cho vào 1 giếng, chứng dương (+) và chứng âm (-) được cho vào các giếng qui định. Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ. Rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch PBS – Tween. Làm khô đĩa. 50 microlit enzyme liên kết kháng thể của P.f 2A10, P.v 210, P.v 247 được cho vào các giếng. Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng. Rửa đĩa 3 lần dung dịch PBS – Tween. Làm khô đĩa. 100 microlit cơ chất enzyme được cho vào các giếng. Đọc kết quả ở máy đọc ELISA.
2.4.2.5. Kỹ thuật thử nhạy cảm
Thử nghiệm nhạy cảm của muỗi với hóa chất theo quy trình của WHO, 2013 [112]. Nồng độ giấy tẩm hóa chất nhóm pyrethroid được sử dụng để xác định mức độ nhạy cảm của muỗi Anopheles với hóa chất diệt muỗi như sau:
lambda - cyhalothrine 0,05 % và alpha - cyprermethrin 30 mg/m2.
Điều kiện lý tưởng cho thử nghiệm là muỗi cái thử nghiệm chưa hút máu, 1 - 2 ngày tuổi, khỏe mạnh. Số lượng ít nhất cho một thử nghiệm là 100 cá thể. Nhiệt độ phòng thử: 25 ± 2 0C, độ ẩm tương đối 70 - 80%.
- Dụng cụ, hóa chất
+ 12 ống nhựa: 5 ống thử nghiệm, 2 ống đối chứng, 5 ống nghỉ.
+ Nắp kéo, vòng kim loại, ống hút muỗi, nhiệt độ, ẩm độ, đường glucose 10%.
+ Giấy tẩm hóa chất alpha - cypermethrin 30 mg/m2, lamda - cyhalothrin 0,05 %.
- Quy trình thử nghiệm
Chuẩn bị các ống nghỉ: Lót các tờ giấy sạch vào bên trong ống nghỉ, dùng các vòng thép bằng ép giấy sát vào thành ống. Cho từ 20 - 25 con muỗi đã chọn vào 1 ống nghỉ. Để muỗi nghỉ 1 giờ, sau đó kiểm tra lại và loại bỏ những con muỗi không đạt yêu cầu, bổ sung thêm muỗi cho đủ số lượng.
Chuẩn bị ống đối chứng và ống thử nghiệm: Lót các tờ giấy đối chứng vào trong ống đối chứng và các tờ giấy có tẩm hóa chất vào trong ống thử nghiệm. Dùng các vòng bằng kim loại ép sát tờ giấy vào thành ống.
Cho muỗi tiếp xúc với giấy tẩm hóa chất: Lắp ống nghỉ với ống đối chứng và ống thử nghiệm. Thổi nhẹ chuyển muỗi từ ống nghỉ sang ống đối chứng/ống thử nghiệm. Đặt ống thử nghiệm có muỗi theo chiều thẳng đứng, thời gian tiếp xúc 60 phút. Theo dõi để nhiệt độ và ẩm độ đạt yêu cầu của thử nghiệm.
Quan sát, đếm, ghi số lượng muỗi ngã gục vào thời điểm 60 phút khi muỗi bắt đầu tiếp xúc với hóa chất.
Sau 60 phút tiếp xúc, chuyển muỗi từ ống đối chứng và ống thử nghiệm sang ống nghỉ. Đặt ống thẳng đứng cho muỗi nghỉ trong 24 giờ. Cho muỗi hút nước đường glucose 10%. Sau 24 giờ đọc kết quả thử nghiệm, muỗi cịn bay được tính là muỗi sống.
Thử nghiệm được tiến hành tại thực địa ở mỗi địa phương.