Nitrit là sản phẩm của chu trình nitơ trong mơi trường nước. Nitrit đi vào tế bào máu cá sẽ lập tức phản ứng với oxyhaemoglobin (oxyHb) hình thành methaemoglobin (metHb) và nitrat, hay phản ứng với deoxyhaemoglobin (deoxyHb) hình thành metHb và NO (Kosaka and Tyuma, 1987; Jensen and Rohde, 2010). Lượng NO này có thể kết hợp với Fe hình thành nitrosyl-Hb (HbNO) hay phản ứng với oxyHb hình thành metHb và nitrat (Jensen, 2009). Cả metHb và HbNO không thể liên kết được với oxy nên dẫn đến oxy trong máu giảm suốt quá trình tiếp xúc nitrit (Jensen, 2007).
4Hb(Fe2+) + NO2- + H+ Hb(Fe3+) + NO + OH- (2)
Hb(Fe2+) + NO Hb(Fe2+)NO (3) Theo Jensen (2003), nitrit không chỉ làm giảm oxy trong máu do metHb
hình thành mà còn ảnh hưởng đến các cơ quan khác qua nhiều cơ chế khác nhau. Tiếp xúc nitrit làm nhịp tim tăng nhanh trên cá hồi (Oncorhynchus mykiss). Nitrit cũng làm tăng sự trao đổi khí qua mang từ sự tăng PO2 (và giảm PCO2) trên cá chép (Jensen et al., 1987; Aggergaard and Jensen, 2001). Kết quả nghiên cứu của Margiocco et al. (1983) cho rằng nitrit không chỉ ảnh hưởng tiêu cực đến mang và máu mà cịn được tích lũy trong gan, não và cơ. Ban đầu lượng nitrit hấp thu vào cơ thể cá chuyển hóa thành nitrat và q trình nitrat hóa này xảy ra ở gan do nitrat được xem khơng có tính độc trong hệ thống thủy sản, sự hình thành nitrat từ phản ứng giữa nitrit và oxyHb là quá trình khử nitrit bởi vì metHb được sinh ra có thể bị giảm để phục hồi lượng Hb chức năng nhờ tăng hoạt tính enzyme khử metHb NADH reductase (Doblander and Lackner, 1997; Jensen, 2003). Tuy nhiên, khi nồng độ nitrit trong mơi trường cao, cá có thể chết do metHb tăng đột ngột quá cao trong máu. Sự hình thành metHb trong trường hợp này gọi là “hiện tượng máu nâu”, một dấu hiệu tiêu biểu khi tiếp xúc nitrit (Kroupova, 2005).
Nồng độ nitrit thơng thường trong nước khoảng dưới 1 µM (Jensen, 2003), nhưng sự sinh ra quá mức của các sản phẩm nitơ, các chất thải hữu cơ hay sinh khối cao có thể làm tăng nồng độ nitrit trong cả hệ thống nuôi trồng thủy sản và hệ thống thủy vực tự nhiên (Eddy and Williams, 1987; Hargreaves, 1998; Jensen, 2003). Sự mất cân bằng của q trình nitrit và nitrat hóa vi khuẩn từ sự hấp thu nitrit qua mang, đặc biệt là lồi cá nước ngọt thì nitrit càng được hấp thu chủ động hơn vì ion Cl- trong nước ngọt rất thấp, nitrit có cùng cơ chế hấp thu vào cơ thể cá với Cl-, làm thay đổi tốc độ trao đổi ion Cl-/HCO3-, thay thế Cl- hấp thu vào cơ thể cá với nồng độ sẵn có của nó trong môi trường nước và làm giảm Cl- trong huyết tương và tăng nồng độ nitrit trong huyết tương (Jensen, 2003). Các lồi cá nước ngọt có đặc điểm ưu trương trong môi trường sống của chúng; chúng cần một kênh trao đổi ion chủ động như Na+ và Cl- qua mang để đền bù lại lượng ion thụ động mất qua mang và nước tiểu. Ngược lại, cá nước mặn lại có tính nhược trương, vì vậy NaCl hấp thụ qua mang chủ động. Thêm vào đó, nồng độ Cl- cao trong nước biển (550 mM) sẽ cạnh tranh với nitrit qua cơ chế đồng vận chuyển (Jensen, 2009).
Một trong những phương pháp để giảm độc tố nitrit là thêm một lượng Cl- vào môi trường (Jensen, 2003; Kroupova, 2005). Phương pháp này lần đầu tiên được nghiên cứu trên cá da trơn và cá hồi từ thập niên 1970 (Lewis and Morris,
1986), và đây được xem là phương pháp để ức chế sự hấp thu nitrit và tính độc của nó với cá. Những lồi có tỉ lệ hấp thu Cl- thấp sẽ có khả năng tích lũy nitrit cao (Jensen et al., 1987; Jensen, 1996, Jensen, 2003). Theo Crawford và Allen (1977), tỉ lệ chết bởi tiếp xúc nitrit ở cá nước ngọt cao hơn ở cá nước mặn khoảng 50-100 lần. Ảnh hưởng của nitrit trên cá măng (Chanos chanos) nước ngọt cao gấp 56 lần so với cá măng nước mặn 16‰ (Almendras, 1987). Ngoài ra, cá chép (Cyprinus caprio) tiếp xúc với 1,45 mM nitrit thì metHb tăng lên 90% sau 48 giờ, trong khi metHb đã giảm chỉ cịn 10% khi mơi trường nước được bổ sung 3,47 mM Cl-. Một số nghiên cứu chỉ ra rằng tỉ lệ [Cl-]:[NO2-]=6:1 được xem là an tồn trong ao ni cá nheo Mỹ (Boyd, 1998). Vì vậy, có thể kết luận rằng khi tiếp xúc nitrit thì lồi cá có tốc độ hấp thu Cl- qua mang cao (ví dụ như cá hồi, cá rơ) nhạy cảm với nitrit hơn lồi có tốc độ hấp thu Cl- thấp (ví dụ như lươn đồng, cá chép) (Williams and Eddy, 1986).
Ở các lồi cá hơ hấp trong nước, mang là cơ quan chính cho sự trao đổi khí, trao đổi ion, điều hịa pH và bài tiết sản phẩm thải nitơ (Evan et al., 2005). Ngồi ra, diện tích bề mặt mang của cá hơ hấp trong nước lớn nên chúng trực tiếp và liên tục hấp thu độc chất từ môi trường như nitrit (Evan et al., 2005).
Tuy nhiên, ở lồi cá hơ hấp khí trời, hệ thống mạch máu biến đổi diện tích bề mặt mang giảm nên hạn chế sự tiếp xúc các chất độc từ môi trường nước (Johansen, 1968; Graham, 1997; Lefevre et al., 2014). Hiện nay, ảnh hưởng
nitrit đã được nghiên cứu trên 6 loài thủy sản (Boudreaux et al., 2007; Lefevre
et al., 2011, 2012; Gam et al., 2017, 2018a, 2018b). Các giá trị LC50-96 giờ
(nồng độ gây chết 50%) của nitrit trên một số lồi hơ hấp trong nước khoảng vài mM (các loài cá chép, Lewis and Morris, 1986); dưới 0,5 mM (các loài cá hồi, Lewis and Morris, 1986). Một cách khác biệt, các lồi hơ hấp khí trời lại có khả năng chịu đựng nitrit cao hơn lồi cá hơ hấp trong nước, các giá trị LC50-96 của nitrit là 1,65 mM ở cá tra (Pangasinodon hypophthalmus) (Lefevre et al.,
2011); 4,9 mM ở cá lóc (Channa striata) (Lefevre et al., 2012); 7,82 mM ở cá thát lát còm (Chitala ornata) (Gam et al., 2017). Tất cả các lồi hơ hấp khí trời này đều có những phản ứng sinh lý khác biệt so với các loài cá trước đây khi tiếp xúc nitrit, như nồng độ metHb chỉ tăng khoảng 20-40% và nitrit trong huyết tương tăng nhưng luôn dưới nồng độ nitrit trong môi trường nước trong 48-72 giờ đầu tiếp xúc; tuy nhiên những chỉ tiêu xúc này đã giảm đáng kể sau 7 ngày tiếp (Lefevre et al., 2011; 2012; Gam et al.,2017; 2018). Sự phục hồi sau khi tiếp xúc nitrit là nhờ q trình nitrat hóa chuyển nitrit thành nitrat (Doblander and Lackner, 1997; Jensen, 2003; Lefevre et al., 2011; 2012; Gam et al., 2017; 2018). Ngồi ra, lồi cá hơ hấp khí trời như thát lát cịm cịn có khả năng giảm metHb khi tiếp xúc nitrit qua sự tăng hoạt tính khử metHb reductase gấp 5 lần
so với cá đối chứng (Gam et al., 2017). Nitrit cũng ảnh hưởng đến qua trình cân bằng axít - bazơ, pH giảm 0,2 đơn vị và PCO2 đã tăng từ 8 mmHg lên 14 mmHg sau 1 ngày tiếp xúc với nồng độ nitrit 2,5 mM (Gam et al., 2017). Môi trường CO2 cao trong nước gây ra sự hơ hấp axít trong cá, dẫn đến thay đổi cơ chế trao đổi ion qua mang (tăng ion HCO3- và giảm ion H+) để trung hịa mơi trường axít (Heisler, 1984; Claiborne et al., 2002; Evan et al., 2005; Perry và Gilmour,
2006). Vì cả nitrit và nồng độ CO2 cao trong nước đều có liên quan đến sự trao đổi ion HCO3-/Cl- qua mang, vì vậy đã có một số nghiên cứu về ảnh hưởng kết hợp của hai yếu tố này lên cân bằng axít - bazơ và sự hấp thu nitrit trên động vật thủy sinh với các kết quả khác biệt nhau (Jensen et al., 2000; Hvas et al.,
2016; Gam et al., 2017). Nghiên cứu của Hvas et al. (2016) cho thấy nitrit (0,9 mM) kết hợp với nồng độ CO2 cao (21 mmHg) chỉ làm giảm sự hấp thu nitrit ở 6 giờ đầu nhưng sau khi pH điều hịa thì lượng nitrit trong huyết tương cũng như metHb lại tăng cao đột ngột gây ra tỉ lệ chết sau 24 giờ. Ngược lại, nghiên cứu của Jensen et al. (2000) trên tôm nước ngọt Astacus astacus và trên cá thát lát còm (Chitala ornata) của Gam et al. (2018) đã phát hiện ra sự điều hòa pH trong quá trình cân bằng axít - bazơ khi chúng tiếp xúc với mơi trường CO2 cao làm ức chế sự hấp thu nitrit vào cơ thể bởi sự giảm trao đổi ion HCO3-/Cl- qua mang.
Tình trạng sức khỏe của sinh vật thường được thể hiện qua các thông số huyết học, trong đó giá trị pH máu là một yếu tố cực kỳ quan trọng (Ashwood
et al., 1983). Trong điều kiện thuân lợi, pH máu cá thường ổn định khoảng 7.5-
7.7(Garey, 1970), và khi môi trường sống thay đổi, pH máu biến động thiên về acid hoặc kiềm đều làm cho hoạt tính của hệ thống enzyme trong tế bào bị ảnh hưởng cũng như tính chất lý hóa học của các chất trong tế bào cũng bị thay đổi gây ảnh hưởng đến chức năng bình thường của cơ thể một cách rõ rệt (Heisler, 1980). Nhiệt độ, CO2 và nitrit luôn là các yếu tố quan trọng ảnh hưởng trực tiếp lên sức khỏe của động vật thủy sinh nói chung và lươn đồng nói riêng. Với môi trường sống đặc thù trong các đầm lầy, thiếu oxy và độc chất cao. Vậy cơ chế điều hịa axít – bazơ trong máu của lươn sẽ hoạt động như thế nào trước ảnh hưởng của các yếu tố môi trường?
PHẦN III
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 09/2014 đến tháng 12/2017
Địa điểm thực hiện: Bộ môn Dinh dưỡng và Chế biến Thủy sản, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ (Việt Nam) và Khoa Sinh học, Trường Đại học Aarhus (Đan Mạch).
Sử dụng nước máy đã khử Clorine cho tồn bộ các thí nghiệm của nghiên cứu. Trong suốt thí nghiệm, chất lượng nước ln được kiểm tra 2 lần/ ngày vào sáng sớm và chiều tối gồm các chỉ tiêu nhiệt độ pH, oxy hòa tan, CO2 hòa tan, tổng nồng độ ammonia (TAN) và nitrit với các thiết bị được trình bày trong mục 3.4.5. Các chỉ tiêu này ln được duy trì ổn định trong giới hạn tốt nhất trong suốt thời gian thí nghiệm giúp nâng cao hiệu quả của các thí nghiệm. Nhiệt độ nước trung bình 27-29°C, pH nước dao động: 7,7-7,8; oxy hòa tan 90%, CO2 hòa tan <0,4% và TAN<0,05M
3.2 Đối tượng nghiên cứu
Lươn đồng (Monopterus albus) trong nghiên cứu được chọn mua từ các trại nuôi tại huyện Vĩnh Thạnh, thành phố Cần Thơ và được chuyển về Phịng thí nghiệm của Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ. Lươn đồng được trữ trong các bể composite có sục khí và thay nước hàng ngày. Lươn đồng được trữ từ 3 đến 4 tuần trước khi thí nghiệm. Trong thời gian trữ, lươn được cho ăn thức ăn tươi sống (cá tạp) 2 lần/ngày theo nhu cầu. Lươn được ngừng cho ăn 3 ngày trước khi bắt đầu bố trí thí nghiệm. Lươn dùng cho các thí nghiệm gồm 2 kích cỡ là lươn nhỏ (30 g/con) và lươn lớn (250-350 g/con).
3.3 Nội dung nghiên cứu
3.3.1 Khảo sát các chỉ tiêu môi trường nước trong các bể nuôi lươn đồng đồng
Phương pháp thực hiện
Khảo sát được thực hiện tại 9 bể nuôi lươn đồng với mơ hình ni có giá thể (vĩ tre), sử dụng thức ăn tươi sống trong suốt thời gian nuôi. Lươn đồng được nuôi với mật độ 250 con/m2 trong bể có diện tích 8-10 m2/bể và được thay nước hằng ngày vào buổi sáng (40-50%). Các yếu tố môi trường được đo dựa theo thời gian nuôi lần lượt là đầu vụ (1 tháng sau thả giống), giữa vụ (4-5 tháng sau thả giống) và cuối vụ (chuẩn bị thu hoạch - 9 tháng sau thả giống); mỗi thời điểm chọn 3 bể khác nhau.
Các chỉ số môi trường và thu mẫu nước được thực hiện mỗi 3 giờ và liên tục trong 24 giờ. Mẫu nước được thu giữa bể và trữ lạnh để phân tích các chỉ tiêu NO2- và H2S tại phịng thí nghiệm; các chỉ tiêu pH, nhiệt độ, PwCO2 (áp suất riêng phần CO2 trong nước) được đo trực tiếp bằng máy OxyGuard Pacific Box, máy YSI để đo oxy hoà tan và nhiệt kế để đo nhiệt độ nước.
3.3.2 Nội dung 1: Ảnh hưởng của CO2 lên sự cân bằng axít - bazơ và các chỉ tiêu sinh lý máu của lươn đồng các chỉ tiêu sinh lý máu của lươn đồng
3.3.2.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Lươn đồng (Monopterus albus) Ảnh hưởng của CO2 lên cân bằng axít-bazơ và sinh lý máu Ảnh hưởng của nhiệt độ lên cân bằng axít-bazơ và
sinh lý máu
Ảnh hưởng CO2 + nhiệt độ lên cân bằng axít-bazơ, sinh lý máu Xác định khảnăng đêm non-bicarbonate Ảnh hưởng CO2lên cân bằng axít-bazơ Ảnh hưởng CO2 + nitrit lên cân bằng axít-bazơ và sinh
lý máu
Ảnh hưởng nhiệt độ + nitrit lên cân bằng axít-bazơ và
sinh lý máu
Ảnh hưởng CO2lên sinh lý máu
Ảnh hưởng của nhiệt độlên pH ngoại bào Ảnh hưởng của nhiệt độlên pH nội bào Ảnh hưởng nhiệt độ
lên sinh lý máu
Ảnh hưởng CO2 + nhiệt độlên cân bằng
axít-bazơlươn lớn Ảnh hưởng CO2 + nhiệt độlên cân bằng
axít-bazơlươn nhỏ
Ảnh hưởng CO2 + nitrit lên cân bằng axít-
bazơlươn lớn Ảnh hưởng CO2 + nitrit lên cân bằng axít-
bazơlươn nhỏ
Ảnh hưởng nhiệt độ+ nitrit lên cân bằng axít-
bazơlươn lớn Ảnh hưởng nhiệt độ+ nitrit lên cân bằng axít-
bazơlươn nhỏ Khảo sát các yếu tốmơi trường
a. Thí nghiệm 1: Xác định khả năng đệm non-bicarbonate (βNB) trong máu trong điều kiện in vitro
Mẫu máu (khoảng 10 mL) được lấy trực tiếp thông qua ống thông động mạch của 6 con lươn đồng lớn. Sau đó, máu được ly tâm nhẹ với tốc độ 600 rpm trong 3 phút ở 27°C nhằm mục đích tách máu thành hai phần, phần lắng bên dưới là máu với hematocrit cao (trên 60%) và phần nổi bên trên với giá trị hematocrit thấp (30%). Mỗi phần máu được cho vào các bình cầu Eschweiler lắc nhẹ trong suốt thời gian thí nghiệm (Hình 3.2A). Sử dụng hệ thống máy Wưsthoff (Bochum, Đức) (Hình 3.2B) để bổ sung vào máu lần lượt 7, 15 và 30 mmHg CO2 trong ít nhất 30 phút cho mỗi mức CO2. Tại mỗi mức CO2, máu được lấy ra để đo tổng nồng độ CO2 (TCO2) của huyết tương, pH máu và Hct. Đối với mỗi mẫu máu, βNB được tính tốn từ mối quan hệ tuyến tính giữa HCO3- và pH, và đánh giá ảnh hưởng của Hct lên mối quan hệ tuyến tính giữa βNB và Hct.
b. Thí nghiệm 2a: Ảnh hưởng của CO2 lên sự cân bằng axít - bazơ của lươn đồng lớn.
- Bố trí thí nghiệm: lươn thí nghiệm có kích cỡ lớn (250-350 g/con). Lươn đồng được đặt ống dẫn lưu động mạch và đặt ống thơng tiểu (Hình 3.3). Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 6 lươn đồng (6 lần lặp lại) và được bố trí vào hệ thống bể nhỏ sử dụng máy điểu chỉnh CO2 (Wösthoff, Bochum, Germany). Hệ thống máy Wưsthoff có cơ chế điều chỉnh đúng áp suất CO2 mong muốn cho từng nghiệm thức theo thí nghiệm. Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện 27°C, oxy hòa tan >90%. Lươn đồng được bố trí riêng biệt từng bể. Các nghiệm thức được bố trí như sau:
Nghiệm thức 1: 0,1 mmHg CO2 trong nước Nghiệm thức 2: 0,1 mmHg CO2 trong khơng khí Nghiệm thức 3: 30 mmHg CO2 trong nước Nghiệm thức 4: 30 mmHg CO2 trong khơng khí
(Áp suất riêng phần CO2 trong nước ở 27°C là 30 mmHg tương đương với 4% CO2 hòa tan trong nước và cũng tương đương nồng độ CO2 là 49,8 mg/L được đo bằng máy Oxyguard Pacific, Đan Mạch).
- Phương pháp thu mẫu và chỉ tiêu phân tích:
Máu lươn đồng được lấy thơng qua ống dẫn lưu tại các thời điểm: 0 giờ, 6 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ.
Mẫu máu được dùng đo các chỉ tiêu như pH, PaCO2 (áp suất riêng phần CO2 trong máu cá) và Hb, Hct. Huyết tương dùng để đo hàm lượng HCO3-, Na+, K+, Cl- và áp suất thẩm thấu.
Lươn được đặt thêm 1 ống thông tiểu trực tiếp vào bàng quang của lươn qua lỗ hậu môn. Nước tiểu lươn đồng được thu liên tục từ ống thông tiểu và chứa trong Eppendorff 10 mL. Các thời điểm thu nước tiểu cũng tương tự như thu máu. Sau đó, nước tiểu lươn đồng được phân tích các chỉ tiêu gồm pH, tổng CO2, TAN, Na+, K+, Cl-.
c. Thí nghiệm 2b: Ảnh hưởng của CO2 lên chỉ tiêu sinh lý máu của lươn đồng nhỏ
- Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên gồm 3
nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần tương ứng với 3 bể. Lươn đồng