4.5 Ảnh hưởng cấp tính của kết hợp CO2 và nitrit lên sự cân bằng axít
4.5.2Ảnh hưởng kết hợp của CO2 cao và nitrit lên một số chỉ tiêu
lý máu của lươn nhỏ
Tác động kết hợp của CO2 và nitrit cao trong môi trường nuôi cũng gây ảnh hưởng lên sự điều hịa axít - bazơ trong máu của lươn đồng nhỏ được thể hiện trong Hình 4.21. Sự kết hợp của 30 mmHg CO2 + 23,57 mM NO2- làm pH máu của lươn đồng nhỏ giảm mạnh sau 24 giờ tiếp xúc (7,01) khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng và so với thời điểm 0 giờ (p<0,05) và làm lươn đồng chết ngay sau đó. Sự giảm mạnh về pH máu dẫn đến sự tăng mạnh áp suất riêng phần CO2 trong máu cũng như nồng độ HCO3- lần lượt là 43 mmHg CO2 và 25,45 mM, khác biệt so với nghiệm thức đối chứng (p<0,05). Ngoài nghiệm thức này, nghiệm thức kết hợp 14 mmHg CO2 và 23,57 mM NO2- cũng làm pH máu giảm mạnh sau 48 giờ (7,32) và pH phục hồi được hơn 90% sau 96 giờ tiếp
xúc độc chất. Sự phục hồi pH được giải thích do sự tăng cao nồng độ HCO3- tương tự như lươn đồng lớn. Tuy nhiên, khả năng chịu đựng của lươn đồng nhỏ kém hơn lươn đồng lớn nên lươn đồng nhỏ chỉ có khả năng chịu đựng và phục hồi pH ở điều kiện 14 mmHg CO2 + 23,57 mM NO2-.
Hình 4.20: Giá trị pH (A), áp suất riêng phần CO2 (mmHg) (B) và nồng độ
HCO3- (mM) (C) trong máu lươn đồng. Dấu (*) cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa
so với 0 giờ trong cùng nghiệm thức (p<0,05) và (+) cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa so với các nghiệm thức trong một giờ nhất định (p<0,05).
Sự điều hịa axít - bazơ trong cơ thể sinh vật cịn chịu ảnh hưởng bởi sự trao đổi các ion trong máu. Sự thay đổi các ion Na+, K+, Cl- và áp suất thẩm thấu trong máu được thể hiện trong Hình 4.22. Nồng độ ion Na+ và Cl- giảm mạnh ở hai nghiệm thức kết hợp CO2 và nitrit cũng như ở nghiệm thức 23,57 mM NO2- khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng (p<0,05). Đặc biệt là nghiệm thức kết hợp 30 mmHg CO2 và 23,57 mM NO2-, nồng độ ion Na+, Cl- giảm mạnh hơn so với lươn đồng lớn ở cùng điều kiện thí nghiệm, sự giảm mạnh nồng độ hai loại ion này gây sự rối loạn trao đổi ion của lươn đồng, làm lươn đồng nhỏ chết sau 24 giờ tiếp xúc. Trong khi đó, lươn đồng lớn vẫn có khả năng thích nghi và bắt đầu phục hồi sau 96 giờ thí nghiệm. Nồng độ ion Na+ ở nghiệm thức kết hợp 14 mmHg CO2 và 23,57 mM NO2- và nghiệm thức 23,57 mM NO2- giảm mạnh nhất ở lần thu mẫu 48 giờ lần lượt là 115 và 125 mM khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng (p<0,05). Sau 96 giờ tiếp xúc, nồng độ ion Na+ có xu hướng tăng về nồng độ ban đầu (0 giờ). Tuy nhiên, nồng độ ion K
cao trên 5 mM ở nghiệm thức kết hợp 30 mmHg CO2+23,57 mM NO2-. Nồng độ ion K+ tăng cao làm tăng nhịp tim của lươn đồng sẽ làm tim ngưng đập nếu ion K+ tăng quá cao. Tương tự xu hướng với lươn đồng lớn, việc giảm đáng kể các ion trong huyết tương làm áp suất thẩm thấu trong huyết tương giảm mạnh, sự thay đổi áp suất thẩm thấu của các nghiệm thức có tiếp xúc CO2, nitrit khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng (p<0,05).
Hình 4.22: Nồng độ các loại ion Na+ (mM) (A), ion K+ (mM) (B), ion Cl- (mM) (C), áp suất thẩm thấu (mOsm) (D) và tỷ lệ metHb (%) (E) sau 96 giờ thí nghiệm. Dấu (*) cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa so với các nghiệm thức trong một
giờ nhất định (p<0,05) và (+) cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa so với 0 giờ trong cùng nghiệm thức (p<0,05)
Bên cạnh các chỉ tiêu về ion, sự thay đổi về một số chỉ tiêu huyết học của lươn đồng cũng thể hiện được tác động của CO2 cao và NO2- cao trong môi trường. Số lượng hồng cầu, bạch cầu và hàm lượng Hb, phần trăm Hct của lươn
đồng nhỏ được thể hiện trong Bảng 4.9. Số lượng hồng cầu tăng nhẹ ở các nghiệm thức có CO2 và nitrit cao, đạt cao nhất sau 96 giờ tiếp xúc với độc chất. Riêng đối với nghiệm thức 30 mmHg CO2+23,57 mM NO2- hồng cầu tăng mạnh sau 24 giờ, xuất hiện rất nhiều hồng cầu vỡ trong máu, khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng và các nghiệm thức còn lại (p<0,05). Hồng cầu tăng nhanh sau đó vỡ cũng là một nguyên nhân gây chết lươn đồng sau 24 giờ. Bên cạnh đó, số lượng hồng cầu ở nghiệm thức 14 mmHg CO2 và 23,57 mM NO2- cũng tăng cao (3,23±0,13x106 tế bào/mm3) khác biệt có ý nghĩa với thời điểm 0 giờ và nghiệm thức đối chứng (p<0,05). Tuy nhiên, số lượng hồng cầu nghiệm thức này tiếp tục tăng đều lên đến 3,38±0,19x106 tế bào/mm3. Nghiệm thức 23,57 mM NO2- có số lượng hồng cầu tăng đáng kể sau 96 giờ, chỉ thấp hơn nghiệm thức kết hợp 0,05x106 tế bào. Bên cạnh, số lượng hồng cầu thì số lượng bạch cầu cũng thay đổi do lươn đồng bị ảnh hưởng bởi CO2 cao và nitrit cao. Tương tự với hồng cầu, bạch cầu cũng tăng cao nhất ở nghiệm thức kết hợp 30 mmHg CO2 và 23,57 mM NO2- lên đến 3,41x104 tế bào/mm3 khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng và so với thời điểm 0 giờ (p<0,05). Số lượng bạch cầu ở nghiệm thức 14 mmHg CO2 + 23,57 mM NO2- và nghiệm thức 23,57 mM NO2- cũng tăng nhất so với nghiệm thức đối chứng và nghiệm thức chỉ 14 mmHg CO2 (p<0,05) sau 96 giờ lần lượt là 3,22 và 3,17x104 tế bào/mm3.
Bảng 4.9: Số lượng các tế bào hồng cầu, bạch cầu, nồng độ Hb và tỷ lệ huyết sắc tố của lươn đồng nhỏ sau 96 giờ tiếp
xúc với CO2 cao, nitrit cao và kết hợp nitrit với CO2.
Chỉ tiêu Nghiệm thức 0 giờ 24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ
Hồng cầu (106 tb/mm3) Đối chứng 3,14±0,04 3,13±0,18 3,16±0,33 3,15±0,18 3,12±0,14 14 mmHg CO2 3,11±0,19 3,20±0,15 3,21±0,12 3,28±0,13 3,31±0,19 23,57 mM NO2- 3,13±0,18 3,19±0,14 3,28±0,07 3,31±0,16 3,35±0,13*+ 14 mmHg CO2+ 23,57 mM NO2- 3,11±0,11 3,23±0,13 3,34±0,20*+ 3,38±0,16*+ 3,38±0,19*+ 30 mmHg CO2+ 23,57 mM NO2- 3,11±0,08 3.57±0,12*+ - - - Bạch cầu (104 tb/mm3) Đối chứng 2,96±0,37 3,03±0,34 3,03±0,54 2,95±0,25 2,89±0,15 14 mmHg CO2 2,91±0,28 3,0±0,28 3.17±0,14 3,23±0,3 3,13±0,32 23,57 mM NO2- 2,98±0,28 3,02±0,47 3.07±0,21 3,08±0,16 3.17±0,31 14 mmHg CO2+ 23,57 mM NO2- 2,91±0,20 3,21±0,25 3,23±0,38 3,25±0,28*+ 3,22±0,19*+ 30 mmHg CO2+ 23,57 mM NO2- 2,8±0,21 3,41±0,29*+ - - - Hb (mM) Đối chứng 11,1±0,54 11,1±0,44 11,3±0,34 11,1±0,27 11,2±0,40 14 mmHg CO2 11,5±0,61 12,1±0,50 11,6±0,37 12,2±0,45 11,8±0,29 23,57 mM NO2- 11,1±0,43 11,2±0,46 12,2±0,58 11,7±0,43 11,9±0,39 14 mmHg CO2+ 23,57 mM NO2- 11,0±0,51 11,5±0,68 12,6±0,87 12,9±0,60 12,0±0,74 30 mmHg CO2+ 23,57 mM NO2- 11,5±0,30 12,8±0,60 - - - Hct (%) Đối chứng 51,1±0,6 50,8±0,4 50,6±0,7 51,1±0,5 50,7±0,4 14 mmHg CO2 50,9±0,5 51,1±0,5 51,4±0,3 51,2±0,5 51,9±0,5 23,57 mM NO2- 50,1±0,5 52,1±0,7 53,6±0,6 54,1±1,0*+ 53,1±0,8 14 mmHg CO2+ 23,57 mM NO2- 50,4±0,6 52,3±0,6 53,4±0,7*+ 54,5±0,7*+ 54,6±0,8*+ 30 mmHg CO2+ 23,57 mM NO2- 50,8±0,6 55,6±1,9*+ - - -
Dấu (*) cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa so với các nghiệm thức trong một giờ nhất định (p<0,05) và (+) cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa so với 0 giờ trong cùng nghiệm thức (p<0,05).
Sự gia tăng số lượng tế bào máu cũng làm thay đổi các chỉ tiêu các trong máu như Hb, Hct. Đặc biệt, khi nitrit xâm nhập vào máu lươn đồng, tỷ lệ metHb cũng gia tăng do nitrit cạnh tranh với oxy kết hợp với nitrit. Tương tự xu hướng với lươn đồng lớn, nồng độ Hb cũng như tỷ lệ huyết sắc tố của lươn đồng tăng cao ở hai nghiệm thức kết hợp CO2 và NO2- nhưng khác biệt không ý nghĩa so với đối chứng cũng như 2 nghiệm thức còn lại (p>0,05). Tuy nhiên, tỷ lệ metHb tăng mạnh ở các nghiệm thức có nitrit, bao gồm nghiệm thức chỉ có nitrit và kết hợp CO2 với nitrit (Hình 4.21). Tỷ lệ metHb tăng cao nhất sau 24 giờ ở nghiệm thức 30 mmHg CO2 và 23,57 mM NO2- là 24,45 %. Tỷ lệ metHb tăng cao nhất lên đến 32,4% sau 72 giờ ở nghiệm thức kết hợp 14 mmHg CO2 và 23,57 mM NO2- khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng và so với 0 giờ (p<0,05). Tỷ lệ metHb ở nghiệm thức 23,57 mM NO2- lại tăng cao nhất là 31,2% chỉ sau 48 giờ tiếp xúc với nitrit. Sau đó, metHb ở nghiệm thức này giảm dần từ sau 48 giờ. Ở hai nghiệm thức khơng có nitrit, tỷ lệ metHb rất thấp và khơng khác biệt so với đối chứng cũng như so với 0 giờ (p>0,05).
4.5.3 Thảo luận
Ảnh hưởng của CO2 và nitrit lên điều hịa axít-bazơ của lươn đồng: Sự
mất cân bằng trong q trình nitrat hóa và khử nitrat hóa của vi khuẩn trong ao nuôi là một nguyên nhân làm tăng cao hàm lượng nitrit (NO2-) trong môi trường nước tĩnh có hàm lượng chất hữu cơ cao (Eddy and Williams, 1994; Jensen, 1995). Nitrit trong môi trường sẽ đi vào huyết tương của cá nước ngọt thông qua mang, nơi mà nitrit sẽ cạnh tranh với ion Cl- để hấp thụ clo hoạt động thông qua kênh trao đổi HCO3-/Cl- (Williams and Eddy, 1988; Jensen, 2003). Sau đó nitrit sẽ xâm nhập vào các tế bào hồng cầu bằng cách khuếch tán thông qua sự khuếch tán các anion hóa trị I và khuếch tán HNO2 cho đến khi đạt được trạng thái cân bằng xuyên màng (Jensen and Rohde, 2010). Khả năng phục hồi pH của lươn đồng khi bị hơ hấp axít gây ra do mơi trường sống tăng tính axít từ việc áp suất riêng phần CO2 tăng lên đến 30 mmHg (tương đương khoảng 4%) đã được thể hiện trong thí nghiệm bổ sung riêng lẻ CO2 cho thấy pH lươn đồng hoàn toàn hồi phục sau 72 giờ tiếp xúc với CO2 cao và nồng độ HCO3- trong huyết tương của lươn đồng tăng cao. Khi kết hợp giữa CO2 cao và nitrit cao đã làm cho nồng độ HCO3- tăng 13,9 mM và 25,4 mM sau 24 giờ tiếp xúc lần lượt cho lươn đồng nhỏ và lươn đồng lớn. Tương ứng với khoảng thời gian đó thì nồng độ ion Cl- và Na+ lại giảm mạnh chỉ sau 24 giờ. Do đó, gần như trao đổi H+/Na+ đóng một vai trị quan trọng trong sự tích lũy của HCO3- trong thời gian ảnh hưởng ban đầu. Q trình điều hịa axít - bazơ cấp tính trên lươn đồng đã được điều hòa qua sự trao đổi H+/Na+ và HCO3-/Cl-. Trong khi đó, nhằm duy trì trạng thái axít - bazơ sau khi pH được đền bù chủ yếu được kiểm soát bởi kênh
ion HCO3-/Cl-. Tuy nhiên, khả năng đền bù pH của nghiệm thức kết hợp thì chậm hơn so nghiệm thức riêng lẻ chỉ nitrit hoặc chỉ CO2. Sự trao đổi HCO3- /Cl- là cơ chế chủ yếu cho sự tích tụ axít ở cá nước ngọt thường được ghi nhận bởi Wood (1991); Goss et al. (1992b); và Perry et al. (2003).
Sự tiếp xúc kết hợp của nitrit và CO2 trên cá tra (Pangasianodon
hypophthalmus) cũng cho kết quả thể hiện cùng xu hướng khi metHb của loài
này đã tăng đột ngột đến 15% và pH giảm mạnh 0,1 đơn vị trong 24 giờ đầu tiếp xúc ở nghiệm thức nitrit đơn lẻ (Hvas et al., 2016). Điều này tương tự khi cá chép (Cyprinus carpio) và cá mút đá Đại Tây Dương (Atlantic hagfish,
Myxine glutinosa) tiếp xúc với nitrit làm giảm pH ngoại bào bởi sự tăng lượng
nitrit tích lũy trong máu (Jensen and Rohde, 2010). Tuy nhiên, lại có những phản ứng tương phản trên tôm nước ngọt (Astacus astacus) (Jensen et al., 2000) và trên cá thát lát còm (Chitala ornata) (Gam et al., 2018). Mặc dù lươn đồng có khả năng điều hịa axít - bazơ hồn tồn sau 72 giờ trong 30 mmHg CO2, nhưng khả năng chịu đựng nitrit lại thấp hơn so với cá thát lát cịm trong suốt q trình tiếp xúc kết hợp nitrit và CO2 (Hvas et al., 2018).
Hầu hết các lồi hơ hấp khí trời, mơi trường CO2 cao sẽ dẫn đến tăng trao đổi khí qua mang từ sự tăng hoạt động hơ hấp khí trời ở một số lồi (Boijink et
al., 2010). Tuy nhiên, vẫn chưa có bằng chứng nào về sự giảm trao đổi khí qua
mang và giảm tốc độ trao đổi chất để giảm sự hấp thu nitrit như hoạt động hơ hấp khí trời (Lefevre et al., 2016), cũng như khơng có nghiên cứu nào về sự sinh ra metHb làm thay đổi tốc độ trao đổi chất trên cá ngựa vằn (Danio rerio) (Jensen, 2007) hay cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) (Lefevre et al.,
2011). Bên cạnh đó, áp suất thẩm thấu của các lồi cá hơ hấp khí trời thường khơng thay đổi trong suốt quá trình tiếp xúc nitrit (Jensen et al., 1987; Stormer
et al., 1996). Trong thí nghiệm này thì lươn đồng ở cả hai kích cỡ đã có sự giảm
sút đáng kể của áp suất thẩm thấu trong huyết tương ở nghiệm thức CO2 đơn lẻ và nghiệm thức kết hợp nitrit và CO2 cho đến cuối thí nghiệm. Điều này tương tự với một số thí nghiệm trước đây trên cá lóc (Channa striata) (Lefevre et al., 2012), các thát lát còm (Chitala ornata) giống (Gam et al., 2017), cá Chitala ornata thương phẩm (Gam et al., 2018a), nơi mà sự giảm nhanh chóng của áp
suất thẩm thấu đã dẫn đến dịch cơ thể cá bị lỗng bởi sự tăng thể tích nước hấp thụ suốt quá trình tiếp xúc nitrit (Jensen et al., 1987; Jensen, 1990a, 1996; Harris and Coley, 1991; Grosell and Jensen, 2000; Gam et al., 2017), làm ngăn chặn sự hấp thu các ion chủ động qua mang và có thể trong thận, làm mất cân bằng điện-nước dẫn đến làm giảm đáng kể các ions Cl- và Na+ (Jensen, 1990b; và Gam et al., 2017). Một khả năng khác giải thích cho điều này là từ sự giảm áp
suất thẩm thấu kéo theo sự tăng tần suất hơ hấp khí trời do nitrit tạo ra sự hơ hấp a-xít (Shartau and Brauner, 2014).
Kết quả tương tự với thí nghiệm trên cá tra (Pangasianodon
hypophthalmus) (Hvas et al., 2014), nghiên cứu này không xuất hiện tỉ lệ chết
khi tiếp xúc kết hợp nitrit và CO2 trên lươn đồng lớn nhưng lươn đồng nhỏ lại chết sau 24 giờ tiếp xúc với 30 mmHg CO2 và 23,57 mM NO2-. Nguyên nhân gây chết đồng loạt lươn đồng nhỏ ở nghiệm thức 30 mmHg CO2 và 23,57 mM NO2- được giải thích do pH máu lươn đồng nhỏ giảm quá thấp sau 24 giờ (pH<7,0) đã làm cho lươn đồng hơ hấp axít trong tình trạng thiếu oxy trầm trọng. Nhằm tăng cường trao đổi chất để cung cấp đủ lượng oxy cần thiết, tim đã tăng cường hoạt động làm hàm lượng ion K+ tăng cao. Khi nồng độ ion K+ tăng cao trên 5 mM sẽ làm tim sinh vật ngừng đập. Chính vì thế nên lươn đồng ở nghiệm thức này đã chết sau 24 giờ và pH máu khơng được đền bù cũng như khơng duy trì được tình trạng cân bằng axít - bazơ trong máu.
Ảnh hưởng kết hợp cũng lúc của CO2 và nitrit lên sinh lý máu của lươn
đồng nhỏ: Khi cá tiếp xúc CO2, sự tích lũy CO2 liên quan đến pH trong máu
giảm, sau đó có thể làm hồng cầu tăng lên (Đỗ Thị Thanh Hương và Nguyễn Văn Tư, 2010). Theo Gam et al. (2018b) thì số lượng hồng cầu ở cá thát lát còm (Chitala ornata) (11 g/con) không bị ảnh hưởng đáng kể khi tiếp xúc với 0,2 mM nitritsau 3 ngày (p<0.05) nhưng mật độ hồng cầu của lươn đồng lại tăng nhẹ khi lươn đồng tiếp xúc với nitrit cao; và nghiệm thức kết hợp CO2 và nitrit thì số lượng hồng cầu cũng tăng trong 72 giờ tiếp xúc. Sự đáp ứng của các tế bào máu là những chỉ số quan trọng trong những thay đổi trong môi trường bên trong hoặc bên ngồi của động vật. Bên cạnh đó thì số lượng bạch cầu cũng đạt giá trị cao nhất sau 3 ngày và cao hơn đáng kể so với ở các mẫu đối (p<0,05).Theo Das et al., (2004a) thì bạch cầu của Cirrhinus mrigala lại giảm
đáng kể sau 6 giờ tiếp xúc với nitrit ở nồng độ 8 mg/L và 10 mg/L; Hồng cầu của cá Catla catla lại giảm lúc 6 giờ và phục hồi lúc 12 giờ khi tiếp xúc trong nitrit là 1,0-10,4 mg/L (Das et al., 2004b). Bạch cầu là thành phần cơ bản của hệ miễn dịch bảo vệ động vật từ sự thâm nhập của vi khuẩn bởi các đại thực bào và kháng thể; số lượng bạch cầu phụ thuộc vào lồi, tình trạng sinh lý, tuổi, dinh dưỡng, nhiệt độ và sự thành thục (Đỗ Thị Thanh Hương và Nguyễn Văn Tư, 2010). Bạch cầu thông thường dao động trong khoảng 10.000-50.000 tế bào/mm3 trong máu cá. Số lượng bạch cầu dao động ở 3 nhóm là đối chứng, nitrit, CO2 trong nghiên cứu này nằm trong khoảng cho phép mặc dù có nó đã tăng liên tục ở nghiệm thức kết hợp nitrit và CO2 suốt thí nghiệm. Điều này cho thấy số lượng bạch cầu được sinh ra liên tục để bảo vệ cá từ các độc chất nitrit