3.4.1 Phương pháp đút ống trực tiếp vào động mạch của lươn đồng
Lươn đồng (250-350 g/con) được gây mê trong nước bằng thuốc mê benzocaine (Merck, Germany) với nồng độ 225 mg/L trong 20 phút trước khi tiến hành phẫu thuật. Quá trình phẫu thuật được tiến hành trong điều kiện vô trùng. Dùng dao phẫu thuật rạch 1 đường nhỏ trên bụng lươn đồng (chiều dài vết mổ khoảng 3 cm). Tiến hành mở bụng lươn đồng và xác định động mạch cần tìm. Cố định động mạch bằng chỉ phẫu thuật (silk 3-0), dùng kéo cắt nhẹ trên thành động mạch 1 lỗ nhỏ, nhanh tay đưa ống dẫn lưu (PE 40) đã chứa dung dịch heparin vào động mạch thông qua lỗ nhỏ vừa tạo. Kiểm tra máu có thể chảy đều trong ơng dẫn lưu, cố định ống dẫn lưu và cột chặt với động mạch lươn đồng tránh gây chảy máu. Cuối cùng, đóng bụng lươn đồng và cố định ống dẫn lưu bằng các vết khâu theo dọc chiều dài của lươn đồng. Lươn đồng sau khi đặt ống được đưa vào các bể chứa nước sạch có sụt khí để phục hồi trong vịng 24 giờ trước khi bắt đầu thí nghiệm.
Ống thơng tiểu của lươn được đặt vào bàng quang của lươn qua lỗ hậu môn. Sau khi thấy nước tiểu chảy vào ống thông tiểu, tiến hành cố định ống thông tiểu bằng các mũi khâu và nước tiểu lươn được chứa trong ống nhựa (10 mL).
3.4.2 Các chỉ tiêu pH, pCO2 và HCO3- trong máu
Giá trị pH và pCO2 trong máu được đo trực tiếp bằng máy đo khí máu cầm tay iStat (Abbott) và được tính đền bù nhiệt độ bằng thân nhiệt của lươn theo Malte el al. (2014). Hàm lượng HCO3 trong huyết tương được đo theo phương pháp Cameron (1971). Các cơng thức tính HCO3- và PCO2 như sau:
[HCO3-] = Total [CO2] - PCO2 * αCO2
PCO2=PCO2 (iStat)*10^(0,019*(Temp-37))*1,13712432-1,038463904 αCO2=1,0064*(10^-1)-5,4431*(10^-3)*Temp+2,1776*(10^-4)*Temp^2 4,9731*(10^-6)*Temp^3+4,5288*(10^-8)*Temp^4
3.4.3 Các chỉ tiêu huyết học
Hồng cầu trong máu cá được nhuộm bằng dung dịch Natt - Herrick theo phương pháp của Natt and Herrick (1952) bằng buồng đếm hồng cầu. Mẫu máu được cố định trên lame và được nhuộm bằng dung dịch Wright & Giemsa để xác định tổng bạch cầu theo phương pháp của Humason (1979).
Hàm lượng Hb đo bằng cách pha lỗng 20 µL máu cá được pha lỗng với 4 mL thuốc thử Drabkin trong cuvet. Dùng máy đo quang phổ đo mức độ hấp
thụ ánh sáng của dung dịch ở bước sóng 540 nm và nhiệt độ 20-25°C. Số lượng huyết sắc tố được tính theo cơng thức:
Số lượng huyết sắc tố mmol/L (A) = (0,019+37,74 x a) x 0,621 (với “a” là hệ số hấp thụ ánh sáng)
Tỷ lệ metHb được xác định bằng dung dịch phosphate buffer 0,02 M- pH 7,3 ở bước sóng 480-700 nm; tỷ lệ metHb được tính bằng phần mềm Sigma plot 12.5 theo phương pháp của Lefevre et al. (2011).
Máu cũng được cho vào ống thủy tinh (hematocrit tube) để đo tỉ lệ huyết sắc tố, ly tâm hematocrit tube bằng máy ly tâm chuyên biệt trong 3 phút với tốc độ 12.000 vịng/phút. Dùng thước đo có chia vạch từ 0-20 cm để xác định tỉ lệ huyết cầu (Larsen and Snieszko, 1961).
3.4.4 Phương pháp phân tích các ion
Hàm lượng ion Na+ và K+ trong huyết tương được đo theo phương pháp quang kế ngọn lửa bằng máy Sherwood Model 420, Sherwood Scientific Ltd., Cambridge, UK20. Ion Cl- được đo bằng máy Sherwood model 926S MK II Chloride analyzer qua phương pháp đo chuẩn độ Cloride. Và áp suất thẩm thấu được đo bằng máy đo Fiske one-ten osmometer (Fiske® Associates, Two Technology Way, Norwood, Massachusetts, USA).
3.4.5 Phương pháp đo và phân tích các chỉ tiêu mơi trường
- Nhiệt độ và pH: được đo bằng máy đo cầm tay Mettler-Toledo (AG 8603
Schwerzenbach, Thụy Sĩ).
- Áp suất riêng phần oxy trong nước (PwO2): được đo bằng thiết bị cầm
tay YSI 556 (YSI, Ohio, USA).
- Áp suất riêng phần CO2 trong nước (PwCO2): đo bằng máy đo Oxyguard
Pacific (Oxyguard International A / S, Farum, Đan Mạch).
- Hàm lượng [NO2-] trong nước: các mẫu nước ở mỗi vị trí lấy mẫu được
chứa trong chai thủy tinh và được bảo quản trong nước đá, sau đó được vận chuyển về Khoa Thủy sản để đo trong ngày. Nitrit được đo quang phổ ở 540 nm (Varian Cary 50 Spectrophotometer, Varian Inc.) sử dụng phản ứng Griess (Lefevre et al., 2011). Nitrate được đo tương tự sau khi giảm nitrat thành nitrit với vanadi (III) clorua (Lefevre et al., 2011; Miranda et al., 2001).
- Hàm lượng H2S trong nước: tương tự các lấy mẫu nước đo nitrit, mẫu
nước được chứa trong chai thủy tinh nâu có nút và được bảo quản trong nước đá, sau đó được vận chuyển về Khoa Thủy sản để đo trong ngày. Sử dụng
phương pháp 4500 – S2- D. Methylene Blue (APHA et al., 1995) để xác định hàm lượng H2S trong nước.
3.4.6 Phương pháp đo và phân tích các chỉ tiêu trong nước tiểu
Nước tiểu được thu từ ống thông tiểu vào các Eppendorf nhằm xác định trực tiếp tỷ lệ lưu lượng nước tiểu (UFR). Giá trị pH nước tiểu được đo bằng điện cực pH Mettler Toledo và nồng độ CO2 tổng được đo theo phương pháp Cameron (1971). Chuẩn độ axít nước tiểu (TA) được đo bằng cách chuẩn độ mẫu nước tiểu với 0,2 M NaOH để đạt được độ pH trong cơ thể được đo ở điều kiện đã cho. Hàm lượng TAN trong nước tiểu được đo theo Scheiner (1976). Hàm lượng các ion Na+, K+ và Cl- được đo tương tự như phương pháp đo trong huyết tương (mục 3.4.4).
3.4.7 Phương pháp đo pH nội bào
Gan, tim và cơ lươn đồng được nghiền mịn trong dung dịch nitơ lỏng (Portner et al., 1990; Brauner et al., 2004; Baker et al., 2009). Tiếp theo, lấy 0,1 g bột cơ đã nghiền cho vào Eppendorf có chứa 0,8 mL chất ức chế (150 mmol/L KF và 6 mmol/L Na2NTA). Dung dịch được trộn đều và ly tâm lạnh ở 3.000 g trong 45 giây; sau đó, lấy dung dịch nổi bên trên (0,2 mL) đem đo pH với máy đo điện cực pH Mettler Toledo.