CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất mang đến khả năng sống sót của
của T. halophilus CH6-2 trong q trình sấy đơng khơ và bảo quản
Sinh khối ướt thu tại mục 2.2.1.1 được chuyển sang môi trường nhân giống MRS sao cho giống cấp đạt OD600nm 1, ủ tại 35℃. Thu tế bào nuôi được sau 3 ngày bằng phương pháp ly tâm lạnh tại 6000 v/ph, 4℃ trong 10 phút. Hoà trộn sinh khối thu được với dịch chất mang với tỉ lệ sinh khối/chất mang 1/2 (w/w). Sau đó hỗn hợp được mang đi sấy đông khô.
Chuẩn bị chất mang: Skim milk (SM), Monosodium Glutamate (MSG), Trehalose (Tre) đều được sử dụng trong thực phẩm. Hoà tan các chất bảo vệ trong nước cất, tiệt trùng tại 121℃ trong 15 phút. Skim milk sẽ được tiệt trùng tại 110℃ trong 15 phút để hạn chế phản ứng Maillard. Sau tiệt trùng, phối trộn đôi một các chất trên để tạo thành tổ hợp chất bảo vệ mới tương ứng với bảng 2.4
Bảng 2.5. Danh sách chất mang và nồng độ chất mang sấy đông khô
CHẤT MANG NỒNG ĐỘ (w/v) SM+Tre 7.2+0.8 SM+MSG 7.2+0.8 SM+MSG+Tre:3/1 7.2+0.6+0.2 SM+MSG+Tre:1/1 7.2+0.4+0.4 2.2.3 Phương pháp phân tích 2.2.3.1. Xác định mật độ vi sinh vật
Tiến hành: chế phẩm được hoà trộn với 1ml nước muối sinh lý vô trùng, pha loãng mẫu bằng ống eppendoft, chang đĩa. Đĩa thạch được nuôi 35℃ trong 3 ngày. Đếm và tính tốn mật độ vi sinh vật theo cơng thức:
Lặp lại thí nghiệm 2 lần
➢ Chang đĩa, ủ trong tủ ấm 3 ngày
➢ Đọc kết quả
24
2.2.3.2. Xác định khả năng sống sót
Khả năng sống sót của vi sinh vật được chia thành 2 giai đoạn - Giai đoạn 1: khả năng sống sót của vi sinh vật ngay sau sấy.
- Giai đoạn 2: khả năng sống sót của vi sinh vật sau các tháng bảo quản. Cơng thức tính: 𝑁 = ∑𝐶 × 𝑉ℎ𝑜à𝑛 𝑛𝑔𝑢𝑦ê𝑛 (𝑛1+ 0.1𝑛2) × 𝑓1× 𝑣 × 𝑚𝑚ẫ𝑢 𝑋 = 𝑁𝑖 𝑁0× 100% Với:
N, Ni: mật độ vi sinh vật sau sấy (hoặc sau các tháng bảo quản) trên 1
gram chế phẩm.
N0: mật độ chủng trước khi sấy (hoặc khi sấy) trên 1 gram tổng chất khô.
∑C: tổng số khuẩn lạc đếm trên đĩa thạch.
n1, n2: số đĩa đọc kết quả ở 2 nồng độ pha loãng liên tiếp
- Độ giảm mật độ vi sinh vật ∆ LogCFU/g:
∆ = 𝐿𝑜𝑔(𝑁0) − 𝐿𝑜𝑔(𝑁𝑖)
Với:
Ni: mật độ chủng sau sấy (hoặc sau các tháng bảo quản) trên 1 gram chế
phẩm.
N0: mật độ chủng trước khi sấy (hoặc sau khi sấy) trên 1 gram tổng chất
khô.
2.2.3.3. Xác định độ ẩm của chế phẩm
Chế phẩm được lấy đại diện mẫu, sấy mẫu tại tủ sấy ở nhiệt độ 105℃ tới độ ẩm khơng đổi.
Cơng thức tính:
𝐻 =𝑚0−𝑚𝑖
𝑚0 × 100%
25 m0: khối lượng chế phẩm trước sấy
mi: khối lượng chế phẩm sau sấy
2.2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu
Mức độ khác nhau có ý nghĩa của khả năng sống sót được tính tốn bằng phần mềm IBM SPSS Statistics 26. Độ tin cậy 95%.
26
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sống sót của T.
halophilus CH6-2 đối với phương pháp sấy phun
3.1.1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy thu sinh khối
3.1.1.1. Trong quá trình sấy
Hình 3.1. Khả năng sống sót của T. halophilus CH6-2 với các mơi trường nhân giống khác nhau trong quá trình sấy phun. Chữ cái trên từng cột thể hiện sự khác biệt có ý
nghĩa giữa các mẫu chế phẩm.
Mơi trường sinh dưỡng có ảnh hưởng đến khả năng chống chịu cũng như hiệu quả tạo chế phẩm khơ. Trong q trình sinh trưởng và phát triển, vi sinh vật phải chịu các điều kiện sốc từ môi trường. Trong nghiên cứu này, hai môi trường được nghiên cứu đó là M7 và MRS được trình bày tại Phụ lục. M7 đã được
nghiên cứu từ trước là môi trường tối ưu cho T. halophilus CH6-2, M7 có khả
năng làm tăng lượng vi sinh vật thu được với chi phí thấp hơn MRS. Với cùng hỗn hợp chất mang, khả năng sống sót sau q trình sấy phun của T. halophilus CH6-2 khi được nuôi cấy trong môi trường M7 là 3.04%, chênh lệch không nhiều so với mẫu được nuôi cấy trong môi trường MRS (2.91%) tại hình 3.1. Sử dụng mơi trường M7 để thu sinh khối trước khi sấy phun sẽ làm giảm chi phí sản xuất của chế phẩm, giảm giá thành của chế phẩm khi đưa ra thị trường.
27
3.1.1.2. Trong quá trình bảo quản
Hình 3.2. Khả năng sống sót của T. halophilus CH6-2 khi sử dụng các môi trường nhân giống khác nhau trong quá trình bảo quản. Các chữ cái a, b trên từng cột thể hiện sự
khác nhau có ý nghĩa giữa các mẫu chế phẩm.
Nếu trong q trình sấy, mơi trường M7 cho thấy hiệu quả về kinh tế, thì trong quá trình bảo quản, khả năng sống sót của chế phẩm chủng T. halophilus CH6-2 được nuôi trong môi trường MRS cao hơn khoảng 6 cho tới 8 lần (trong 3 tháng bảo quản sau sấy phun) so với chủng nuôi trong môi trường M7. Hiện tượng này có thể được giải thích là do sự sinh trưởng trong các môi trường với các chất dinh dưỡng khác nhau, dẫn đến sự tổng hợp các chất khác nhau, từ đó khả năng chịu đựng trong q trình bảo quản khác nhau [65]. Sự vắng mặt của Tween 80 cũng có thể là nguyên nhân dẫn đến khả năng sống sót của chủng giảm. Kết quả tương tự cũng quan sát thấy trong nghiên cứu của Parlindungan trên chủng L. plantarum B21 [60].
Sau 3 tháng bảo quản, môi trường nuôi cấy thu sinh khối cho kết quả ΔLogCFU/g thấp hơn, đạt 2.20 LogCFU/g. Trong khi đó, sử dụng môi trường M7 nuôi cấy cho ΔLogCFU/g đạt 3.1 LogCFU/g. Sử dụng môi trường MRS cho kết quả khả năng sống sót tốt hơn trong quá trình bảo quản.
28
3.1.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ sinh khối/chất mang
3.1.2.1. Trong quá trình sấy
Hình 3.3. Khả năng sống sót của T. halophilus CH6-2 với các tỉ lệ khối lượng sinh khối với chất mang sau quá trình sấy. Các chữ cái a, b trên từng cột thể hiện sự khác biệt có
ý nghĩa giữa các mẫu chế phẩm.
Để sản xuất chế phẩm chứa mật độ vi sinh vật cao, việc nâng cao mật độ vi sinh vật trước sấy cần được nghiên cứu. Dựa trên các nghiên cứu của Palmfeldt, Broeckx và Reddy, khi tăng tỉ lệ sinh khối/chất mang, mật độ vi sinh vật, cũng như khả năng sống sót tăng dần, tuy nhiên các tác giả cũng chỉ ra rằng tỉ lệ sinh khối chất mang quá cao cũng làm giảm khả năng sống sót của vi sinh vật [66-68]. Hình 3.3 so sánh khả năng sống sót của 2 mẫu tỉ lệ sinh khối/chất mang 1/3 và 1/20. Có thể thấy, mẫu có tỉ lệ 1/3 đạt khả năng sống sót cao hơn, lên tới 2.91%, gấp khoảng 29 lần so với mẫu tỉ lệ 1/20. Trong đó, độ giảm mật độ
T. halophilus CH6-2 trong mẫu giảm từ 3.000 còn 1.530 LogCFU/g (bảng 3.2).
Kết quả của thí nghiệm trái ngược với nghiên cứu của Broeckx khi tăng tỉ lệ sinh khối/chất mang từ 1/4 tới 4/1 với mật độ vi sinh vật ban đầu từ 10.970 LogCFU/g tới 11.430 LogCFU/g dẫn đến giảm khả năng sống sót của chủng [67], Broeckx giải thích điều này có thể do ảnh hưởng của nồng độ chất khô tăng cao [19]. Mặt khác, kết quả có sự tương đồng với nghiên cứu của Palmfeldt, khi khả năng sống sót của vi sinh vật sau sấy đơng khô đạt cao khi mật độ tế bào nằm trong khoảng từ 109 tới 1010, ngồi khoảng đó khả năng sống sót sẽ giảm mạnh [66]. Một nghiên cứu khác của Reddy khi sử dụng các tỉ lệ sinh khối chất mang 1/10, 3/10 và 5/10, kết quả cho thấy khả năng sống sót ở 3 thí nghiệm khơng có sự khác biệt, mẫu 5/10 có sự giảm nhẹ [68]. Nghiên cứu của Reddy cũng chỉ ra
29 rằng, sử dụng chất mang skim milk cùng với điều kiện lượng sinh khối ban đầu cao, khả năng sống sót của chế phẩm được đảm bảo [68]. Tỉ lệ sinh khối/chất mang là 1/3 cho kết quả tốt tương tự trong nghiên cứu của Reddy [68].
3.1.2.2. Trong quá trình bảo quản
Hình 3.4. Khả năng sống sót của T. halophilus CH6-2 khi sử dụng các tỉ lệ sinh khối/chất mang khác nhau trong quá trình bảo quản. Các chữ cái a, b trên từng cột thể
hiện sự khác biệt có ý nghĩa giữa các mẫu chế phẩm.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ sinh khối/chất mang (LogCFU/g) tới khả năng sống sót của T. halophilus CH6-2. Tỉ lệ sinh khối /chất mang Mật độ vi sinh vật (LogCFU/g) ∆ LogCFU/g Trước khi
sấy Sau khi sấy
Sau 3 tháng bảo quản
1/20 9.630 6.630 5.106 4.524
1/3 12.107 10.573 8.368 3.739
Ảnh hưởng của tỉ lệ sinh khối chất mang tới khả năng sống sót trong quá trình bảo quản sấy phun được thể hiện tại hình 3.4. Sau 3 tháng bảo quản, khả năng sống sót của chủng trong mẫu tỉ lệ 1/20 cao hơn gấp 4.9 lần so với mẫu tỉ lệ 1/3. Tuy nhiên, LogCFU/g T. halophilus CH6-2 sau bảo quản tại mẫu 1/3 thấp hơn nhiều so với mẫu 1/20 đồng thời mật độ vi sinh vật sống sót của mẫu tỉ lệ 1/3 đạt 8.368 LogCFU/g cao hơn rất nhiều so với mẫu tỉ lệ 1/20 chỉ đạt 5.106 LogCFU/g (bảng 3.2). Có thể nói, mẫu tỉ lệ 1/3 thích hợp hơn trong nghiên cứu này. Điều này được Reddy giải thích nhờ cơ chế tự bảo vệ của các tế bào vi sinh
30 vật, chúng tập hợp gần nhau, trong quá trình sấy, các tế bào bao xung quanh chết, khi đó chúng trở thành 1 lớp bảo vệ thứ 2, tăng khả năng bảo vệ trong cả quá trình sấy và quá trình bảo quản [68].
3.1.3 Ảnh hưởng của chất mang
3.1.3.1. Trong quá trình sấy
Hình 3.5. Khả năng sống sót của T. halophilus CH6-2 khi sử dụng các chất mang khác nhau trong q trình sấy, thí nghiệm 1 (sử dụng tỉ lệ sinh khối chất mang 1/20). Các chữ cái a, b, c trên từng cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa giữa các mẫu chế phẩm.
Các chất mang khác nhau dẫn đến khả năng sống sót trong q trình sấy phun của T. halophilus CH6-2 khác nhau. Khi sử dụng tỉ lệ sinh khối/chất mang thấp (1/20), khả năng sống sót của hệ chất mang chứa SM thường cao hơn (KNSS đạt từ 0.077% tới 0.182%) so với hệ chất mang không chứa SM (KNSS chỉ đạt từ 0.003 tới 0.02%). Trong hình 3.3, khả năng sống sót đạt giá trị cao nhất (0.182%) đối với mẫu sử dụng chất mang SM+MSG (10+10), trong khi đó, khả năng sống sót đạt thấp nhất đối với mẫu sử dụng chất mang MD, thấp hơn 0.01% (tương ứng với mức giảm số tế bào sống sót LogCFU/g là 4.48).
Soukoulis (2013) cũng có kết quả tương tự, khi hệ thống các chất mang có chứa MD đều cho khả năng sống sót thấp hơn chất mang chứa SM đối với chủng
L. acidophilus NCIMB 701748 sau quá trình sấy phun (khả năng sống sót của
31 năng bảo vệ T. halophilus CH6-2 trong quá trình sấy, cũng như sử dụng MD làm chất mang không đảm bảo được mật độ vi sinh vật đáp ứng với nhu cầu sử dụng chế phẩm. Trong khi đó, MSG dường như có hiệu quả đối với chủng khi hỗn hợp chất mang chứa MSG đều đạt giá trị cao. Glutamate cũng đã được chứng minh là tiền chất của proline – một chất được cho là tăng cường khả năng chống chịu của tế bào, từ đó có thể tăng cường khả năng sống sót của vi sinh vật [65].
Bảng 3.2. Hiệu suất thu hồi sử dụng tỉ lệ SM và MSG khác nhau
Chất mang Nồng độ (% w/v) Hiệu suất thu hồi (%) Toutlet
SM+MSG 19+1 50.67 84 ± 3℃ 15+5 47.62 10+10 49.05 5+15 35.14 1+19 31.14
Hình 3.6. Khả năng sống sót của T. halophilus CH6-2 khi sử dụng các tỉ lệ SM/MSG khác nhau trong q trình sấy thí nghiệm 2 (sử dụng tỉ lệ sinh khối chất mang 1/20). Các chữ cái a, b, c trên từng cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa giữa các mẫu chế
32 Sự bổ sung MSG kết hợp với hợp chất carbohydrate làm tăng đáng kể khả năng sống sót của T. halophilus CH6-2 ngay sau sấy (hình 3.5) do vậy trong thí
nghiệm này SM và MSG được phối trộn với các tỉ lệ khác nhau. Khả năng sống sót của T. halophilus CH6-2 thể hiện ở hình 3.4 cho thấy khi sử dụng hệ chất
mang SM+MSG tỉ lệ 15+5 và tỉ lệ 19+1 (p<0.05), khả năng sống sót cao rõ rệt, nồng độ MSG càng cao thì khả năng sống sót của T. halophilus CH6-2 càng
giảm. Tỉ lệ SM/MSG 5+15 và 1+19 đạt khả năng sống sót thấp nhất (p<0.05). Có thể thấy khả năng bảo vệ của MSG đạt hiệu quả nhất khi tỉ lệ nồng độ MSG thấp hơn 25% (so với tổng nồng độ chất mang). Hàm lượng MSG trong hỗn hợp càng tăng, khả năng sống sót sau q trình sấy phun càng giảm. Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của Golowczyc (2011) trên chủng Lactobacillus kefir
CIDCA 8321 và L. kefir CIDCA 8348 [70].
Một yếu tố khác có ảnh hưởng tới hiệu quả sản xuất chế phẩm đó là hiệu suất thu hồi sau quá trình sấy. Khối lượng thu hồi sau sấy được tổng hợp tại bảng 3.1. Mẫu SM+MSG 19+1 có hiệu suất thu hồi lớn nhất, đạt 50.67%. Tỉ lệ MSG càng cao thì hiệu suất thu hồi càng giảm. Có thể giải thích hiệu suất thu hồi của chế phẩm phụ thuộc phần lớn vào thành phần chất mang. Theo tổng kết của Huang, thông thường các chất mang là vật liệu vơ định hình, có nghĩa là chúng sẽ biến đổi giữa các trạng thái khác nhau, thông số quyết định trạng thái của chúng được gọi là nhiệt độ chuyển tiếp tinh thể [19]. Trong quá trình sấy phun, nhiệt độ sấy tăng dần, nếu nhiệt độ của hạt lớn hơn nhiệt độ chuyển tiếp tiếp tinh thể, các hạt chất mang sẽ chuyển hoá từ dạng tinh thể thành dạng vơ định hình. Trong trạng thái vơ định hình, các hạt này dính với nhau, tạo thành các hạt có kích thước lớn, dẫn đến khả năng bay hơi nước của chúng kém [49], đây cũng có thể là lý do lý giải thích cho khả năng sống sót của chủng kém hơn. Hơn nữa, các hạt này bám dính trên thành thiết bị, và dính các hạt khác trong q trình phun, từ đó giảm hiệu suất thu hồi của chế phẩm [19, 71].
33
Hình 3.7. Khả năng sống sót của T. halophilus CH6-2 khi sử dụng các chất mang khác nhau trong quá trình sấy (sử dụng tỉ lệ sinh khối/chất mang 1/3). Sử dụng chất mang SM+MSG, SM+S, Tre+MSG (A); sử dụng chất mang SM+Tre, SM+Tre+MSG (B) Các
chữ cái a, b, c trên từng cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa giữa các mẫu chế phẩm.
Khi sử dụng tỉ lệ sinh khối/chất mang 1/3, yếu tố chất mang có ảnh hưởng tương tự khi sử dụng tỉ lệ sinh khối/chất mang 1/20. Hình 3.7A biểu diễn ảnh hưởng tích cực của MSG khi có mặt trong hệ chất mang khi khả năng sống sót của mẫu SM+MSG và Tre+MSG lần lượt là 6.9% và 4.5%, trong khi SM+S chỉ đạt 0.64%. Sử dụng hệ chất mang chứa SM và 1 loại đường (carbohydrate như maltodextrin trong hình 3.5), khả năng sống sót của chế phẩm giảm mạnh trong quá trình sấy. Điều này cũng được thể hiện khi tăng hàm lượng carbohydrate sử dụng trong hệ 3 chất mang SM+Tre+MSG (tỉ lệ 4+15+1, hình 3.5B), khả năng sống sót giảm cịn 1.818%. Có thể thấy, nồng độ của nhóm chất carbohydrate làm giảm khả năng sống sót của chủng trong q trình sấy. Trong nghiên cứu của Robert, MSG trong hệ Tre + MSG làm tăng khả năng sống sót của chủng
Lactobacillus rhamnosus GG [58]. Robert đề cập đến vai trò của MSG như 1
chất chống oxy hố, giúp tế bào sống sót tốt hơn trong q trình sấy phun [58]. Tựu chung lại, khả năng sống sót sau q trình sấy khi sử dụng tỉ lệ sinh khối chất mang 1/3 tăng lên rõ rệt. Đồng thời ảnh hưởng của chất mang trong các thí nghiệm sử dụng tỉ lệ sinh khối chất mang 1/3 có xu hướng tương tự như khi ở tỉ lệ 1/20. Nghiên cứu của Palmfeldt cũng cho kết quả tương tự khi tăng tỉ lệ sinh khối chất mang (mật độ vi sinh vật ban đầu), khả năng sống sót cũng tăng, [66].
34
3.1.3.2. Trong q trình bảo quản
Hình 3.8. Khả năng sống sót của T. halophilus CH6-2 khi sử dụng các chất mang khác nhau trong quá trình bảo quản sau 1 tháng (sử dụng tỉ lệ sinh khối chất mang 1/20).