L oi III ạ: enzym nh n bit trình tậ ếự và ct DNA ắở vị trí cách đĩ 20 nu III Quy trình th c hi n RFP bao g m các bựệồước:
a. Chu yn DNA sang màng nylon ể
– C t DNA thành cácắ đo n nhạ ỏ b ng enzim gi i h n thích h p.ằ ớ ạ ợ
– Ði n di s n ph m c t trên gel Agaroseệ ả ẩ ắ để tách các đo n DNA theoạ
kích thước.
– Làm bi n tính DNA, khi DNA cịn trên gel b ng dung d ch ki m.ế ằ ị ề
Ví dụ: cĩ thể nhúng DNA vào trong dung d ch NaOH 0.5M : NaCl 1.5M,ị
DNA s i kép sẽợ được tách thành DNA s iợ đ n.ơ
– Chỉ DNA s iợ đ n m i cĩơ ớ thể chuy n lên màngể lai.Chuy nể DNA đã bi n tính lên màng lai.ế
– Màng lai được sử d ng làụ màng nitrocellulose. Người ta cũng cĩ thể sử d ng màng nylon. Màng nitrocelluloseụ đi n hình cĩể khả năng ti p nh n 100µg DNA/cmế ậ 2, trong khi màng nylon cĩ khả năng ti p nh nế ậ
500µg DNA/cm2. M t khác màng nylon cĩặ khả năng giữ DNA ch c h nắ ơ
và ít đ t gãy h n. Vi c chuy n DNA thứ ơ ệ ể ường được ti n hành b ng ho t tínhế ằ ạ
mao d n trong kho ng vài giẫ ả ờ ho c cĩặ thể dùng m t thi t bộ ế ị th m chânấ
khơng. N u dùng thi t bế ế ị th m chân khơng thìấ sẽ nhanh h n, chơ ỉ m tấ
kho ng m t gi . Trong quáả ộ ờ trình chuy n, vể ị trí các đo n DNA v nạ ẫ được giữ nguyên khơng thay đ i.ổ
Vật nặng Tấm kính giấy thấm Màng lai Gel Giấy thấm dầy Dung dịch chuyển
Acid nucleic được chuy n lên màng lai nhể ờ l c mao d n.ự ẫ
b. Cách ch nọ đo n dịạ (probes)
Probe (đo n dị) làạ m t s iộ ợ nucleic acid (ho cặ ribonucleic acid) cĩ trình tự xác đ nh vàị được đánh d u b ng các phấ ằ ương pháp khác nhau dùng để nh n di n cácậ ệ đo n nucleic acid khác cĩạ trình tự bổ sung v i nĩ.ớ
Quá trình này d a trên nguyên t cự ắ bi n tínhế và h i tínhồ c a phânủ
tử DNA, được g i làọ lai phân tử DNA. Các phương pháp cổ đi n cĩể sử d ngụ
Blot (nh n di n các phiên b n c aậ ệ ả ủ gene). Cơng nghệ DNA chip và cDNA micro-arrays được thi t kế ế d a trên nguyên t c sự ắ ử d ng các probe c a cácụ ủ
phương pháp lai phân tử nh ng cho phép nghiên c uư ứ đ ng lo t hàng nghìnồ ạ
gene khác nhau.
+ Probe cĩ thể được thi t kế ế d a trên nh ng trình tự ữ ự cĩ s nẵ
tuỳ vào m c đích c a t ng thíụ ủ ừ nghi m vàệ các thơng tin đã cĩ.
+ D a trên trình tự ự genome c aủ đ i tố ượng nghiên c uứ để nh nậ
di n các b n sao c a gen ho c s n ph m RNA c a gen.ệ ả ủ ặ ả ẩ ủ
+ D a trên trình tự ự genome c a các sinh v t cĩủ ậ quan hệ g n gũiầ
v iớ đ i tố ượng nghiên c u nh m tìm ki m gen ch c năngứ ằ ế ứ được b o t n quaả ồ
quá trình ti n hố.ế
+ D a trên trình tự ự amino acid c a protein làủ s n ph m c a gene.ả ẩ ủ
Từ đĩ tìm ki m trình tế ự tr n v n c a gene mãọ ẹ ủ hố cho protein đĩ trên genome.
Trong quá trình thi t kế ế đo n dịạ c n b oầ ả đ m các y u tả ế ố sau: 1)
tính đ c tr ng c a probe, 2) khơng cĩặ ư ủ hi n tệ ượng lai chéo gi a các probeữ
ho c t o c u trúc khơng gian n i t i trong probe, 3) giáặ ạ ấ ộ ạ trị nhi tệ độ bi nế
tính (Tm) ph i phùả h p khi th c hi n phép lai nhi u probe m t lúc.ợ ự ệ ề ộ
c. Cách ghi nhãn đo n dịạ cho phương pháp lai Southern
Cách ghi phĩng xạ
Thường dùng:3 H, 32P, 33P, S 35
M u dịẫ được đánh d u trong m t ph nấ ộ ả ng sao chép DNA nhứ ờ m tộ
dNTP mang ch tấ địng vị phĩng xạ
Xem k t qu : phĩng xế ả ạ tự ghi (autoradiograph)
Cách ghi huỳnh quang
M u dịẫ được đánh d u trong m t ph nấ ộ ả ng sao chép DNA nhứ ờ m tộ
dNTP mang ch t phát huỳnh quangấ
Xem k t qu : máyế ả đo huỳnh quang
u Ư
đi m vàể khuy tế đi m c a kỹể ủ thu t RFLPậ
– RFLP cĩ uư đi m làể marker đ ng tr i cho phép phân bi tồ ộ ệ được cá thể đ ng h p vàồ ợ dị h p. Do kích thợ ước DNA kh o sát trong RFLP l nả ớ
vì v y sậ ố lượng d u phân tấ ử (marker) t o ra nhi uạ ề đủ đáp ng nhu c uứ ầ
nghiên c u.ứ
– Tuy nhiên do qui trình th c hi n ph c t p, nguy hi mự ệ ứ ạ ể đ i v i s cố ớ ứ
cĩ ch t lấ ượng cao đã làm h n chạ ế vi c sệ ử d ng kỹụ thu t này. H n n a hi nậ ơ ữ ệ
nay, ở nước ta nhà nước ch a cho phép nh p các ch t phĩng x .ư ậ ấ ạ
– Cùng v i sớ ự phát tri n kỹể thu t PCR, kỹậ thu t RFLP trậ ở nên đ nơ
gi n h n. M t c p m i oligonucleotide cĩả ơ ộ ặ ồ thể dùng khu chế đ i m t vùngạ ộ
DNA c n kh o sát, sauầ ả đĩ đo n DNAạ được khu chế đ iạ được c t b ng cácắ ằ
RE, đi n di vàệ phân tích trên gel nhu m ethidium bromide ho c b c. PCR-ộ ặ ạ
RFLP bỏ qua bước lai nên giá thành rẻ h n vàơ ít nguy hi m h n phể ơ ương pháp RFLP.
IV. ng d ng:Ứ ụ
– Tr n Thanh M nầ ế đã sử d ng kỹụ th ât PCR-RFLPụ để nghiên c uứ đa d ng sinh h c các gi ng bạ ọ ố ưởi (Citrus maxima (Burm.) Merr.) ở Vi t Nam.ệ
Th c hi n ph nự ệ ả ng PCR v i 2 c p m i ITS 1 vàứ ớ ặ ồ ITS 2; ITS 1 và ITS 4. Các s n ph m PCR c a t ng c p m iả ẩ ủ ừ ặ ồ được c t b ng 6 enzim gi i h n SmaI,ắ ằ ớ ạ
EcoRI, HindIII, PstI, BamHI, KpnI. D a vào k t quự ế ả thu được ta xác đ nhị được m i tố ương quan di truy n c a các gi ng cây này.ề ủ ố
– Bác sĩ Lê Nh t Minh, Phan Lêậ Thanh Hương và Lê Thị Kim Tuy nế đã sử d ngụ kỹ thu t PCR-RFLPậ để xác đ nh m t sị ộ ố vi khu nẩ là căn nguyên chính gây viêm màng não ở trẻ em. Kỹ thu t PCR sậ ử d ng m t c pụ ộ ặ
m i chung cho phép nhân lên m tồ ộ đo n DNA cĩạ kích thước 996bp trên gen mã hĩa cho y u tế ố 16S ribosom c a 11 lồi vi khu n, sauủ ẩ đĩ s n ph mả ẩ
PCR được c t b ng enzim Hae III k t quắ ằ ế ả đã phân bi tệ được 11 lồi vi khu n chu n khác nhau vàẩ ẩ xác đ nh chính xác 9 lồi vi khu n làị ẩ căn nguyên chính gây viêm màng não ở trẻ em.(Trích H i nghộ ị Khoa h cọ – 2006 – Vi nệ
Pasteur TP.HCM)
KỸ THU T PCR (Polymerase Chain Reaction)Ậ
I. Gi i thi uớ ệ
PCR là chữ vi t t t c a c m tế ắ ủ ụ ừ Polymerase Chain Reaction
(Ph nả ng chu i trùng h pứ ỗ ợ – ph nả ng khu chứ ế đ i gen).ạ Đây là kỹ thu tậ
c a sinh h c phân tủ ọ ử cho phép nhân b n m tả ộ đo n DNA mong mu nạ ố
từ hệ gen DNA c a củ ơ thể sinh v t thành nhi u b n sao, kỹậ ề ả thu t nàyậ được nhà khoa h c ngọ ười Mỹ – Kary Mullis và c ng sộ ự phát minh năm 1985 t iạ
cơng ty Cetus; m c dùặ nguyên t c nàyắ đã được mơ tả chi ti t trế ước đĩ m tộ
th p niên b i Khorana vàậ ở ctv., (Kleppe và ctv., 1971; Panet và ctv., 1974), và được gi i thi u l nớ ệ ầ đ u tiên t i H i th o l n thầ ạ ộ ả ầ ứ 51 ở Cold Spring Harbor
vào năm 1986 và ơng đã nh nậ được gi i thả ưởng Nobel Hố sinh h c vàoọ
năm 1993. Kể từ đĩ đã t o nên m t tácạ ộ đ ng to l nộ ớ đ i v i các nghiên c uố ớ ứ
sinh h c trên tồn thọ ế gi i.ớ
Nguyên lý nhân gen trong tế bào:
DNA là v t ch t di truy n c a cậ ấ ề ủ ơ thể s ng quyố đ nh lênị đ c tính c aặ ủ
cơ thể (ngo i trạ ừ m t sộ ố lo i virus cĩạ v t ch t di truy n làậ ấ ề RNA). Đ i v iố ớ
nh ng sinh v t cĩữ ậ c u trúc tấ ế bào nhân chu n, các phân tẩ ử DNA t n t iồ ạ
dướ ại d ng k t h p v i protein thành các nhi m s c thế ợ ớ ễ ắ ể trong nhân tế bào.
Ngồi ra, t i các cạ ơ quan tử như ty thể và l p thạ ể (ở th c v t) cũng ch aự ậ ứ
DNA ở d ng plasmid.ạ
Các phân tử DNA ở nh ng tữ ế bào ho tạ đ ng bình thộ ường chỉ được nhân lên trong quá trình phân bào nguyên nhi m. Đễ ể th c hi nự ệ được quá trình này, địi h i ph i cĩỏ ả m t enzim DNA polymerase, sặ ự tham gia c aủ
các đo n m i cĩạ ồ trình tự bổ sung g n vào vào s i DNA khuơn vàắ ợ các dNTPs làm ngu n cung c p nucleotit. Trong quáồ ấ trình phân bào nguyên nhi m, cácễ
s i DNA képợ được mở xu n tách thành các s i DNA s iắ ợ ợ đ n. Dơ ưới tác d ngụ
c a enzim DNA polymerase, quáủ trình t ng h p DNAổ ợ đượ ảc x y ra theo cách g n l n lắ ầ ượt các nucleotit vào đo n m iạ ồ để kéo dài chu i theo nguyên t cỗ ắ
bổ sung v i DNA khuơn.ớ
Nguyên lý c a kỹủ thu t PCRậ
Kỹ thu t t ng h p DNA ngồi cậ ổ ợ ơ thể cũng tuân thủ nh ng nguyênữ
t c cắ ơ b n c a sao chép DNA trong cả ủ ơ thể nh ng cĩư sự khác bi t:ệ
+ Dùng nhi tệ độ cao tháo xo n thay cho enzim helicase.ắ
+ K t h p v i enzim DNA polymerase ch u nhi tế ợ ớ ị ệ để t ng h p DNAổ ợ
m i trong mơi trớ ường thích h p.ợ
+ Hệ th ngố đi u nhi t thích h p cùng v i cácề ệ ợ ớ đo n m iạ ồ được thi tế
kế chuyên bi t, chệ ủ đ ng.ộ
Phương pháp PCR cho phép t ng h p r t nhanh vàổ ợ ấ chính xác t ngừ đo n DNA riêng bi t.ạ ệ Ðây th c sự ự là phương pháp hi nệ đ i vàạ thu nậ
ti n cho vi c xácệ ệ đ nh sị ự cĩ m t c a m t gen nàoặ ủ ộ đĩ trong tế bào v iớ độ chính xác cao.
Phương pháp này d a trên sự ự khám phá ho t tính sinhạ
h cọ ở nhi tệ độ cao c a DNA polymeraseủ được tìm th y trong các sinhấ
v tậ a nhi t (vi khu n s ng trong các su i nư ệ ẩ ố ố ước nĩng). Ph n l n các DNAầ ớ
polymerase chỉ làm vi cệ ở nhi tệ độ th p. Nh ngấ ư ở nhi tệ độ th p, DNAấ
xo n ch t vìắ ặ v y DNA polymerase khơng cĩậ nhi u khề ả năng làm bi n tínhế
ph n l n các ph n c a phân t . Nh ng các polymerase ch u nhi t nàyầ ớ ầ ủ ử ư ị ệ
ho tạ đ ngộ ở nhi tệ độ r t cao, cĩấ thể lên đ n 100ế 0C. Ở nhi tệ độ này DNA sẽ bị bi n tính (DNA d ng xo n sẽế ạ ắ du i ra vàỗ ở d ng th ng).ạ ẳ
M t ph nộ ả ng PCR làứ m t chu i nhi u chu kỳộ ỗ ề n i ti p nhau, m iố ế ỗ
chu kỳ g m ba giaiồ đo n: giaiạ đo n bi n tính, giaiạ ế đo n b t c p, giaiạ ắ ặ đo nạ
kéo dài.
III. Máy PCR
Trước đây, khi ch a cĩư máy chu kỳ nhi t,ệ để th c hi nự ệ được ph nả ng PCR các nhàứ khoa h c g p 2 trọ ặ ở ng i l n:ạ ớ
+ Lúc đ u enzim Klenow polymeraseầ được sử d ng bụ ị phân
h yủ ở 950C nên ph i thêm enzim vàoả ng nghi m sau m i chuố ệ ỗ
kỳ ở giai đo n phân tách chu i DNA.ạ ỗ
+ Để thay đ i chu kỳổ nhi t các nhàệ khoa h c ph i sọ ả ử d ng 3 waterụ
baths ở 3 nhi tệ độ khác nhau. Khi đ m vàế thay đ i 30ổ đ n 35 chu kỳế nhi tệ
khá phi n ph c, dề ứ ễ gây sai sĩt.
Vi c tìm ra enzimệ Taq polymerase và máy PCR tự đ ng thayộ đ i cácổ
chu kỳ nhi tệ đã làm cho kỹ thu t này phát tri n nhanh vàậ ể được ng d ngứ ụ
r ng rãi trong nhi u lĩnh v c nghiên c u (McPherson vàộ ề ự ứ ctv., 1992).
M t cách t ng quát, máy PCR g m các bộ ổ ồ ộ ph n chínhậ như sau :
+ M t bàn phímộ đ n gi nơ ả để l p các chậ ương trình chu kỳ nhi tệ
và ra các m nh l nhệ ệ để máy th c hi n.ự ệ
+ M t bộ ộ vi xử lý để ghi nhớ các chương trình đã n p vào máy,ạ
th c hi n các m nh l nh cũng nhự ệ ệ ệ ư ghi nh n cách thayậ đ iổ
nhi tệ độ bu ngồ ủ PCR trong các chu kỳ nhi tệ để đi u ch nh choề ỉ đúng v iớ
chương trình đang được th c hi n.ự ệ
Bu ngồ ủ PCR là n i màơ các chu kỳ nhi tệ được th c hi n qua sự ệ ự đi uề
khi n c a bể ủ ộ vi xử lý. Trong các chu kỳ nhi t, nhi tệ ệ độ trong bu ngồ ủ PCR cĩ thể đ a lên cao hay hư ạ xu ng th p trong m t th i gian r tố ấ ộ ờ ấ
ng n.ắ Ðể làm thay đ iổ được nhi tệ độ trong bu ngồ ủ PCR, cĩ hai phương pháp :
(1) Liên t c th i lên bu ngụ ổ ồ ủ nh ng lu ng khíữ ồ nĩng sinh ra từ m tộ đèn phát nhi t, hay lu ng khíệ ồ l nh sinh ra tạ ừ m t hộ ệ th ng c aố ủ
máy làm l nh. V i phạ ớ ương pháp này, máy luân nhi t hãy cịn tệ ương đ iố
c ng k nh, kháồ ề đ t ti n vàắ ề khi máy ho tạ đ ngộ âm thanh cũng khá n ào.ồ
(2) Phương pháp thứ hai ho tạ đ ng d a theo hi u quộ ự ệ ả Peltier ngược. Hi u quệ ả Peltier là nguyên t c c a các máyắ ủ đo nhi tệ độ đi n tệ ử : Khi áp hai
mãnh kim lo i vào nhau vàạ khi cĩ sự cách bi t nhi tệ ệ độ gi a hai mãnh kimữ
lo i thìạ sẽ sinh ra m t dịngộ đi n và chính sệ ự l u thơng c a dịngư ủ đi n nàyệ
Hi u quệ ả Peltier ngượ ạ ậc l i v n hành theo ki u ngể ượ ạc l i, nghĩa là khi t oạ
ra m t dịngộ đi n gi a hai mãnh kim lo i thìệ ữ ạ sẽ t o raạ được m t sộ ự cách
bi t nhi tệ ệ độ gi a hai mãnh : bên này nĩng, bên kia l nh. Khi thayữ ạ đ iổ
chi u dịngề đi n thìệ nhi tệ độ c a hai mãnh cũng thayủ đ i ngổ ượ ạc l i: bên này l nh, bên kia nĩng. Các máy chu kỳạ nhi t hi n nayệ ệ đ uề được chế t oạ
d a theo phự ương pháp thứ hai này, nhờ v y màậ máy trở nên r t g n nh ,ấ ọ ẹ
giá thành rẽ h n g p nhi u l n so v i trơ ấ ề ầ ớ ước đây. IV. Chu n bẩ ị m u DNAẫ
M u DNA c aẫ ủ đ i tố ượng c n nghiên c uầ ứ được ly trích và tinh s ch,ạ
sau đĩ trữ m uẫ ở – 200C.
V. Thi t kế ế m iồ
– M i làồ nh ngữ đo n oligonucleotide (18-24 base) bạ ổ sung v i trìnhớ
tự trên DNA, g m cĩồ m i xuơi vàồ m i ngồ ược
M i xuơi (sense primer ho c Forward) b t c p v i m chồ ặ ắ ặ ớ ạ
khuơn c a DNA vàủ sẽ kéo dài theo chi u phiên mã.ề
M i ngồ ược (anti sense primer ho c Reverse) b t c p v i m chặ ắ ặ ớ ạ
mã c a DNA vàủ sẽ kéo dài ngược theo chi u phiên mã.ề
+ Trình tự c a m iủ ồ được thi t kế ế sao cho khơng cĩ sự b t c pắ ặ
gi a m i xuơi vàữ ồ m i ngồ ược, kể cả c u trúc k p tĩcấ ẹ
+ Nhi tệ độ g n m i c a m i xuơi vàắ ồ ủ ồ m i ngồ ược khơng được chênh l ch quáệ xa (Khơng nên quá nhi u G ho c C n i ti p nhau, thề ặ ố ế ường tỷ lệ G, C n m trong kho ngằ ả 30%< G+C<70%
+ M i ph i b oồ ả ả đ mả đủ dài để b t c p chính xác.ắ ặ