2.PHƯƠNG TIN VÀ Ệ PHƯƠNG PHÁP 2.1/Trích DNA từ vi khu n gamẩ âm

V t thy tinh, nha ự

2.PHƯƠNG TIN VÀ Ệ PHƯƠNG PHÁP 2.1/Trích DNA từ vi khu n gamẩ âm

REPORT THIS AD

2.1.1/Phương ti nệ

 Micropipette

 Ống tube 1.5 và 2.2 ml  Máy l cắ ủ

 TE pH8  Proteinase K  Isopropanol  Cloroform/Isoamylalchohol (24:1)  SDS  10% CTAB/0.7M NaCl 2.1.2/Phương pháp Chu n bẩ ị m u:ẫ

Nuơi vi khu nẩ E.Coli trong 6ml mơi trường LB (Luria Broth) nuơi qua đêm, ủ ở 370C

Trích DNA:

Bước 1: Ly tâm thu sinh kh i vi khu n:ố ẩ Cho vào 3 túp (2,2ml) m iỗ

túp 2ml dung d ch vi khu nị ẩ E.coli đã được nuơi c y quaấ đêm. Sau đĩ, li tâm ở 13000rpm trong 10 phút. Li tâm xong lo i bạ ỏ ph n trong l y ph nầ ấ ầ

t a phía dủ ưới.

Bước 2: hịa tan DNA: B m 250ml TE pH 8 vào túp thơ ứ nh tấ để hịa tan k t t aế ủ ở túp thứ nh t, sauấ đĩ chuy n ph n dung d chể ầ ị ở túp thứ nh tấ

sang túp thứ hai, túp thứ hai sang túp thứ ba, hịa tan DNA ở túp thứ ba. REPORT THIS AD

Bước 3: chi t xu t DNA:ế ấ Sau đĩ, cho thêm vào túp 50ml dung d chị

10% SDS c ng 5ml proteinase K l cộ ắ đ u,ề ủ 20 phút ở nhi tệ độ 65oC, m i 5ỗ

phút đ o ngả ược túp m t l nộ ầ để tr nộ đ u dung d ch, cĩề ị tác d ngụ

phá vỡ màng tế bào và màng nhân, chi t xu t vàế ấ tinh s ch DNA.ạ

Bước 4: t o ph c v i CTABạ ứ ớ : Sau khi hịa tan h t t a ta cho thêmế ủ

vào túp 400ml CTAB và ủ ở 65oC trong 20 phút, kho ng 5 phútả đ oả

ngược ng túpố để tr nộ đ u.ề

Bước 5: lo i bạ ỏ protein và các ph c h p:ứ ợ Ti p t c thêm 600mlế ụ

chloroform:isoamylalcohol (24/1), l cắ đ u vàề li tâm ở 13000 vịng trong 10 phút để lo i bạ ỏ protein, nh ng polysaccharide vàữ các ph c h p trên.ứ ợ

Bước 6: t a DNAủ : Li tâm xong, chuy n 500mlể ph n trongầ ở phía trên vào túp m i vàớ thêm 1ml isopropanol l cắ đ u, giề ữ ở – 20oC trong 30 phút nh m m cằ ụ đích t a DNA, khơng cho DNA bi n tính, thuủ ế được DNA nhi u h n vàề ơ b o vả ệ chúng kh i sỏ ự phân h y c a các enzyme. Ti n hành liủ ủ ế

tâm ở 13000 vịng trong 10 phút để t p trung lậ ượng DNA k t t aế ủ

xu ngố đáy túp.

Bước 7: lo i bạ ỏ ph n d ch trongầ ị : Sau khi li tâm, ta lo i bạ ỏ ph nầ

d ch trongị ở phía trên và thu ph n k t t aầ ế ủ ở phía dưới.

Bước 8: r a t aử ủ : R a t a v i 1ml ethanol 70% ly tâmử ủ ớ ở 13000rpm trong 5 phút, làm 2 l nầ để lo i bạ ỏ mu i bám trong DNA vàố lo i bạ ỏ lượng isopropanol cịn l i trong DNA (m i l nạ ỗ ầ đổ bỏ ethanol).

Bước 9: ph i khơơ DNA: R a DNA xong, ta ti n hành ph i DNA quaử ế ơ

đêm ở nhi tệ độ phịng cho s ch h t ethanol tránhạ ế nh hả ưởng đ n DNAế

t ng s .ổ ố

REPORT THIS AD

Sau đĩ, hịa tan DNA b ng 30ml nằ ước c t, l cấ ắ đ u cho DNA tan raề

và ti n hànhế đo OD

2.2/Trích DNA từ tơm 2.2.1/Phương ti nệ

 Cơ tơm hay bi u bì dể ưới da đ u tơmầ

 Dung d ch trích Lysis bufferị

 TE buffer 0.1X  Máy ly tâm  Micropipette  Ống tube 1.5 và 2.2 ml  Kéo, k p, đ a th y tinhẹ ủ ủ 2.2.2/Phương pháp Chu n bẩ ị m u:ẫ

Tơm đem b c bố ỏ vỏ ở ph n l ng tơm, dùng kéo c t kho ng 100mgầ ư ắ ả

th t tơm cho vào túp 2,2ml. Sauị đĩ, dùng đũa th y tinh nghi n m u thànhủ ề ẫ

b t m n.ộ ị

Trích DNA:

Bước 1: phá vở màng tế bào: M u sau khi nghi n m n cho thêmẫ ề ị

vào túp 400ml dung d ch trích buffer D giúp phá vị ở màng tế bào, l cắ đ uề

và ủ qua đêm ở nhi tệ độ 50oC REPORT THIS AD

Bước 2: tách protein và các thành ph n h u cầ ữ ơ ra kh i DNA:ỏ Sau khi ủ xong, ta cho thêm vào túp 400ml dung d chị

chloroform:isoamylalcohol (24:1) để tách protein và các thành ph n h uầ ữ

cơ khác (polysaccharides, polyphenols, lipids,…), l c nhắ ẹ r iồ đem ly tâm v i v n t c 13000 vịng/phút trong th i gian 10 phút.ớ ậ ố ờ

Bước 3: t a DNAủ : Ta ti n hành hút 300ml ph n d ch trongế ầ ị ở phía trên cho qua m t túp 2,2ml m i, sauộ ớ đĩ thêm vào túp này 150ml 7,5M ammonium acetate và 600ml ethanol 96% cĩ tác d ng giúp DNA k t t a.ụ ế ủ

L c nhắ ẹ và ti n hành li tâm v i v n t c 13000 vịng/phút trong 5 phút.ế ớ ậ ố

Bước 4: r a DNA:ử Sau khi li tâm xong, ta lo i bạ ỏ ph n d chầ ị

trong ở trên l y ph n c nấ ầ ặ ở phía dưới. R a ph n c n v i 600ml ethanolử ầ ặ ớ

70% 2 l nầ để lo i bạ ỏ mu i ra kh i DNA. Ly tâm 13000 vịng/phút trong 5ố ỏ

phút sau m i l n r a.ỗ ầ ử Đổ bỏ ethanol sau m i l n r a.ỗ ầ ử

Bước 5: s y khơấ DNA: S y khơấ b ng máy ly tâm chânằ

khơng ở nhi tệ độ 45oC trong 15 phút, tránh trường h p m u DNA cịn ch aợ ẫ ứ

ethanol sẽ nh hả ưởng đ n DNA t ng s .ế ổ ố

Bước 6: hịa tan DNA: Sau khi s y m u xong, hút 30ml nấ ẫ ướ ấc c t cho vào túp ch a DNAứ để hịa tan DNA.

Sau đĩ hút 10ml dung d ch này cho vào túp 1,5ml m iị ớ đã hút s nẳ

90ml nướ ấ ắc c t, l c đ u. Sauề đĩ đem m uẫ đo OD.

2.3/Trích DNA từ th c v tự ậ 2.3.1/Phương ti nệ

 Lá bưởi Di nễ

 Bộ đi n di minisub gel.ệ

 Kéo c t m u, chày và c i nghi n m uắ ẫ ố ề ẫ

 Micropipette

 Ống tube 1.5 và 2.2 ml  Extraction buffer (EB)  CTAB buffer

 Agarose  Isopropanol

 Cloroform/Isoamylalchohol (24:1)

 Nitơ l ngỏ

REPORT THIS AD

2.3.2/Phương pháp Chu n bẩ ị m u:ẫ

M u láẫ bưởi được khử trùng b ng c n 70ằ ồ o (dùng bơng gịn th m c nấ ồ

và lau đ u trên cề ả hai bề m t lá), dùng kéo c t l y ph n th t láặ ắ ấ ầ ị ở hai bên và bỏ ph n gân láầ ở gi a. Ph n th t láữ ầ ị được gĩi trong gi y nhơm vàấ ngâm nitơ l ng trong th i gian 15 phút. Sauỏ ờ đĩ, nghi n kề ỉ m u b ng c iẫ ằ ố

và chày đã được khử trùng b ng cách ngâm nitằ ơ l ng. Trong quáỏ trình nghi n ta thêm nitề ơ l ng vào nh m m cỏ ằ ụ đích c chứ ế các enzym gây bi nế

tính DNA c a lá, m uủ ẫ được nghi n choề đ n khi thành b t m n.ế ộ ị

Trích DNA:

Bước 1: phá vở màng tế bào và màng nhân: Chuy n ph n b t m nể ầ ộ ị

vào túp 2,2ml. Ti p t c cho 50ml dung d ch SDS 10% vào túp cĩế ụ ị tác d ngụ

giúp DNA dễ hịa tan h n, sauơ đĩ l c nhắ ẹ túp (tránh DNA bị gãy).

Bước 2: ủ m uẫ : M u sau khi thêm các dungẫ

d chị đem ủ ở nhi tệ độ 65oC trong 30 phút, trong quá trình ủ kho ng 5ả

phút đ o nhả ẹ túp để tr n m u.ộ ẫ

Bước 3: li tâm: Sau th i gianờ , m uủ ẫ được đem li tâm v i v n t cớ ậ ố

13000rpm trong 10 phút, để tách các thành ph n khác nhau c a tầ ủ ế bào.

Bước 4: t a DNAủ : Li tâm xong ta hút 800ml ph n dung d chầ ị

trong ở phía trên cho vào túp m i, sauớ đĩ cho 800ml dung d ch isopropanolị

vào túp và ti n hànhế ủ trong th i gian kho ng 30 phútờ ả ở -20oC để k t t aế ủ

DNA, khơng cho DNA bi n tính, giúp tăng khế ả năng thu DNA. Ở đi u ki nề ệ

này nhi u protein vàề các ch t khác cũng bấ ị k t t a cùng ADN nên trongế ủ

m u sẽẫ bị l n t p. Sau đĩ, ti n hành li tâm v i v n t c 13000rpm trong 10ẫ ạ ế ớ ậ ố

phút.

Bước 5: hịa tan t aủ : Li tâm xong, ph n d ch trongầ ị được bỏ vào m tộ

cái h p mũộ cĩ ch aứ nước và thu ph n k t t a. Hịa tan t a DNA trongầ ế ủ ủ

400ml TE, TE giữ DNA nổ đ nh, khơng bị ị bi n tính.ế

Bước 6: t o ph c v i CTABạ ứ ớ : Sau khi t a hịa tan h t ta cho thêmủ ế

vào túp 400ml CTAB và ủ ở 65oC trong 15 phút, kho ng 5 phútả đ oả

ngược ng túpố để tr nộ đ uề

Bước 7: lo i bạ ỏ protein và các ph c h p:ứ ợ Sau đĩ cho thêm vào túp 800ml Chloroform/Isoamylalcohol l cắ đ u và li tâm v i v n t c 13000rpmề ớ ậ ố

Bước 8: t a DNA:ủ Sau khi ly tâm ta ti n hành hút 650ml ph n d chế ầ ị

trong ở phía trên cho qua m t túp 2,2ml m i, thêm vào túp này 1.4mlộ ớ

Ethanol 96% ủ ở nhi tệ độ phịng trong vịng 15 phút để t a DNA vàủ b oả

vệ chúng kh i sỏ ự phân h y c a các enzyme. Sauủ ủ đĩ, li tâm ở 13000rpm trong 10 phút.

Bước 9: r a DNAử : Li tâm xong đổ bỏ ph n d ch trongầ ị ở phía trên vào h p mũộ cĩ ch a nứ ước, thu l y ph n k t t aấ ầ ế ủ ở phía dưới. Sau đĩ, ti nế

hành r a k t t a v i ethanol 70%ử ế ủ ớ để lo i bạ ỏ mu i ra kh i DNA. Ph n k tố ỏ ầ ế

t aủ được r a 2 l n v i ethanol 70% (khơng gây h i cho DNAử ầ ớ ạ

do ở n ngồ độ th p). M i l n r a cho 400ml ethanol 70% vào túp, l cấ ỗ ầ ử ắ

nhẹ và đem li tâm trong 5 phút v i v n t c 13000rpm, sau đĩ lo iớ ậ ố ạ

bỏ ethanol.

Bước 10: s y khơấ DNA: S y khơấ b ng máy ly tâm chânằ

khơng ở nhi tệ độ 45oC trong 15 phút, tránh trường h p m u DNA cịn ch aợ ẫ ứ

ethanol sẽ nh hả ưởng đ n DNA t ng s .ế ổ ố

Bước 11: hịa tan DNA: DNA sau khi s y khơấ được hịa tan v iớ

100ml TE 0.1. Dung d ch DNAị được dùng để ch yạ đi n di.ệ