VI. Các ng d ng ụ
8. Kim tra ch ểấ ượng DNA:
Đo quang phổ Ch yạ đi n diệ
Ki m tra ch t lể ấ ượng DNA là bước c n thi t trong quy trình chi tầ ế ế
xu t DNA.ấ
Thí d :Sụ ố lượng và ch t lấ ượng DNA cĩ thể nh hả ưởng đ n k tế ế
quả c a PCR vìủ m t lộ ượng DNA dư th a cĩừ thể c chứ ế sự khu chế đ iạ
nh ngữ đo n DNA mong mu n.ạ ố
Bi tế được n ngồ độ DNA sẽ dễ dàng tính tốn được số lượng c nầ
dùng c a các lo i enzyme c t gi i h nủ ạ ắ ớ ạ để c t DNA. Thơng thắ ường 1 unit enzyme c tắ được 1 µg c a DNA tinh khi t.ủ ế
1.2.2.1/Đo quang phổ Nguyên t cắ :
Nguyên t c c a phắ ủ ương pháp này là d a vào sự ự h p thấ ụ m nhạ ánh sáng c a m t ch tủ ộ ấ ở m t bộ ước sĩng xác đ nh. Nucleic acid h pị ấ
thụ m nhạ ánh sáng tử ngo iạ ở bước sĩng 260 nm do sự cĩ m t c a baseặ ủ
purine và pyrimidine. Giá trị m tậ độ quang ở bước sĩng 260nm (OD260nm) c a các m u cho phép xácủ ẫ đ nh n ngị ồ độ nucleic acid trong m u.ẫ
REPORT THIS AD
Đ n vơ ị OD260nm tương ng n ngứ ồ độ 50ng/ml cho m t dungộ
d ch ADN s iị ợ đơi.
Do đĩ n ngồ độ ADN trong m uẫ được tính theo cơng th c sau:ứ
CADN (ng/ml) = OD260nm * 50 * Độ pha lỗng
Để ki m traể độ s ch c a dung d ch, ngạ ủ ị ười ta đo thêm giá trị OD ở 280 nm (OD280nm). Ở bước sĩng này, các protein cĩ m c h pứ ấ
thụ cao nh t. Ngồi ra, các protein cũng h p thấ ấ ụ ánh sáng ở bước sĩng 260 nm như các nucleic acid và do đĩ làm sai l ch giáệ trị th t c aậ ủ
n ngồ độ nucleic acid. M t dung d ch nucleic acidộ ị được xem là s ch (khơngạ
t p nhi m protein) khi tạ ễ ỷ s :ố
OD260nm/OD280nm n m trong kho ng 1.8ằ ả – 2
Các bước đo OD:
Chu n bẩ ị m u DNAẫ đo OD: Hồ 10ml d ch ADN c nị ầ đo vào 90ml nước khử ion vơ trùng
Đo đ i ch ng:ố ứ L y 100ml nấ ước khử ion vơ trùng vào
cuvet, đo ở bước sĩng 260nm, 280nm.
Đo m u: L y 100ml m u DNAẫ ấ ẫ đã chu n b ẩ ị ở trên vào
Đ cọ độ h p thấ ụ trên máy đo quang ph ổ ở bước sĩng 260 nm, 280 nm. Xử lý số li u theo cơng th c:ệ ứ
N ng đ DNA sẽ là:ồ ộ OD 260 * 50 ng/µl * đ pha lỗngộ
REPORT THIS AD
1.2.2.3/Đi n di Gel Agaroseệ Nguyên t cắ
Đi n di gel agarose làệ phương pháp thơng d ng, thích h pụ ợ
dùng để tách r i cácờ đo n acide nucleic cĩạ kích thướ ừ 200bp đ n 50kp.c t ế
Agarose là ch t chi t xu t tấ ế ấ ừ 1 lồi rong bi n, agarose cĩể c u trúcấ
polymer th ng, hi n nay ngẳ ệ ười ta đã chế t oạ được nhi u lo i agaroseề ạ đ cặ
bi tệ để phân tích DNA, RNA như agarose tan ở nhi tệ độ th p nh : lowấ ư
meeting agarose, metaphore agarose
Gel agarose được đổ b ng cáchằ đun agarose trong dung d chị đ mệ
thích h p choợ đ n khi cĩ màu tr ng trong vàế ắ cho đ c l i b ng cáchặ ạ ằ đổ vào khuơn và để ngu i. Khiộ đ c l i agarose t o nên m ng lặ ạ ạ ạ ưới mà kích thước c a nĩủ phụ thu c n ngộ ồ độ agarose và dung d chị đ m.ệ
Khi n m trong gel cĩằ pH >7 DNA sẽ tích đi nệ âm, dưới tác d ngụ
c aủ đi n trệ ường thì DNA sẽ ch y vạ ề phía anode. V n t c di chuy n c aậ ố ể ủ
DNA phụ thu c vào các thơng sộ ố sau:
Kích thước DNA: kích thước càng l n thì DNA di chuy n càngớ ể
ch m và ngậ ượ ạc l i.
N ng đồ ộ agarose: tùy kích thước DNA mu n phân tích mà taố
ch n n ng đọ ồ ộ agarose thích h p. Kích thợ ước DNA càng nhỏ thì n ngồ
độ agarose ph i càng l n.ả ớ
Ki n trúc DNA: v i cùng kích thế ớ ước, tùy ki n trúc: siêu xo n,ế ắ
vịng hay th ng mà t c đẳ ố ộ di chuy n c a DNA khác nhau. T c dể ủ ố ộ di chuy nể
cũng phụ thu c vào dung dich đ m và lộ ệ ượng ethidium bromide. Ở đây chúng ta khơng nghiên c u kỹứ về v n đấ ề này.
Cường độ dịng đi n: Đệ ộ phân ly c a gel agarose gi m khiủ ả
cường độ dịng đi n tăng cao. Cệ ường độ đi n trệ ường khơng đượ ớc l n h nơ
5V/cm (tính từ kho ng cách 2 đi n c c)ả ệ ự
Thành ph n base và nhi t đ : trong trầ ệ ộ ường h p n ngợ ồ
độ agarose th p h n 0.5% thìấ ơ ph i đi n diả ệ ở 40C n u khơng thành ph nế ầ
Ethidium bromide: ethidium bromide nh hả ưởng đ n 15% t cế ố
độ di chuy n c a các c a các đo n DNA th ngể ủ ủ ạ ẳ
Dung d ch đ m đi n di: dung d ch đ mị ệ ệ ị ệ nh hả ưởng đ n DNAế
trong gel. Trường h p n ng đợ ồ ộ dung d ch đ m quá cao gel sẽị ệ bị ch y vàả
DNA bị bi n tính.ế
REPORT THIS AD
Các bước th c hi nự ệ Bước 1: Đổ gel:
Dùng băng keo dán ch t haiặ đ u c a khayầ ủ đi n di,ệ đ t lặ ược s nẳ ở 1 đ u khay.ầ Đ t khayặ ở n i b ng ph ng, dùng mi ng b tơ ằ ẳ ế ọ
khí để ki m tra.ể
Cân 0.4g agarose cho vào bình tam giác 250ml, thêm 50 ml nướ ấc c t. L c nhắ ẹ cho agarose hịa l n trong nẫ ước.
Đ t bình tam giác vào lị vi song đun kho ng 3-5 phút. Dung dichặ ả
trong bình tam giác trở thành màu tr ng trong.ắ
L y bình tam giác ra,ấ đ i 15 phút rợ ờ th y v a nĩng (60ấ ừ oC) thì đổ nhẹ dung d ch vào khayị đi n di. Kho ng 45 phút thìệ ả agarose đ c l i,ặ ạ
gel đ i thành màu tr ngổ ắ đ c.ụ
Bước 2: Ch y gel.ạ
Đ t khay vào bặ ể đi n di, l y nhệ ấ ẹ lược ra, khơng làm đ ngộ đ n gel.ế
Thêm dung dich đ mệ đi n di phệ ủ m t gel kho ng 1mm.ặ ả
Dùng pipette P100 hút 10ul loading buffer chia thành 4 gi t trênọ
paraffin
Dùng pipette P100 hút 10ul m u, tr n v i 1 gi t loading buffer sauẫ ộ ớ ọ
đĩ load vào gi ng. Gi ngế ế đ u tiên cĩầ thể ch y DNA chu n.ạ ẩ
Kh iở đ ng ngu nộ ồ đi n, ch n voltage thích h p. Nh n nút Run.ệ ọ ợ ấ
REPORT THIS AD
DNA sẽ ch y tạ ừ c cự âm sang c c dự ương. Do DNA mang đi n tíchệ âm (các g c phosphate mangố đi n tíchệ âm đ a ra ngồi)ư
Sau khi DNA ch yạ được h n 2/3 m u gel thìơ ẫ nh n nút stop. L yấ ấ
khay đi n di ra.ệ
Nhu m gel v i Ethidium Bromide.ộ ớ
In k t qu .ế ả
1.2.3/Chu n bẩ ị các dung d ch , mơi trị ường và d ng cụ ụ 1.2.3.1/Các bước chu n bẩ ị dung d ch,mơi trị ường
Chu n bẩ ị dung d ch stock.ị
Pha chế mơi trường. Khử trùng o Khử trùng nhi t khơ.ệ o Khử trùng nhi tệ ướt. o Khử trùng mơi trường. o Khử trùng v t d ng.ậ ụ Chú ý khi khử trùng
Ø Khơng bao giờ khử trùng micropipette.
Khơng bao giờ khử trùng gi y th m b ng nhi t khơ.ấ ấ ằ ệ
Nh ng ch t kháng sinh khơng đữ ấ ược khử trùng b ng autoclave.ằ
Nh ng v t d ng b ng th y tinh, nh a ph i đữ ậ ụ ằ ủ ự ả ượ ử ạc r a s ch.