L oi III ạ: enzym nh n bit trình tậ ếự và ct DNA ắở vị trí cách đĩ 20 nu III Quy trình th c hi n RFP bao g m các bựệồước:
3. dNTP (deoxy nucleoside triphosphate), tc là ứđ nơ
vị để cĩ thể t ng h pổ ợ được các b n sao c a DNAả ủ đích. dNTP cĩ c u t oấ ạ
g m m tồ ộ đường deoxyribose cĩ g n m t base, cĩắ ộ thể là Adenine (dATP) hay Thymine (dTTP) hay Cytosine (dCTP) hay Guanine (dGTP) , ở carbone
số 1 (C1). Ba phân tử phosphate (triphosphate) được g n t i carbone sắ ạ ố 5
(C5) c a phân tủ ử deoxyribose này và đây chính là n i màơ dNTP g nắ
vào đ u 3’ầ c a chu i bủ ỗ ổ sung trên chu i DNAỗ đích. Năng lượng để cho ph nả ng này x y raứ ả đượ ấc l y từ các n i phosphate giàu năng lố ượng c aủ
triphosphate trên dNTP. Ðĩ cũng chính là lý do t i sao ph i làạ ả dNTP ch ngứ
khơng ph i làả dNDP (diphosphate) hay dNMP(monophosphate). M i (primer)ồ
M i làồ nh ngữ đo n DNA s iạ ợ đ n ng n vàơ ắ c n thi t cho vi c xúc ti nầ ế ệ ế
ph nả ng dây chuy n t ng h p DNA. Chúng nh n ra ph n DNA c nứ ề ổ ợ ậ ầ ầ được nhân lên, b t c p bắ ặ ổ sung v i m tớ ộ đ u c a DNA m u vàầ ủ ẫ t o raạ
vị trí b tắ đ u tái b n. Các m i này cĩ chi u ngầ ả ồ ề ược nhau, bao g m m t m iồ ộ ồ
xuơi (forward primer) và m t m i ngộ ồ ược (reverse primer).
M i làồ y u tế ố quan tr ng nh t c a ph nọ ấ ủ ả ng PCR, quy tứ ế đ nhị
tính đ c hi uặ ệ c a ph nủ ả ngứ
Trong thử nghi m PCR,ệ đo n m i cĩạ ồ hai vai trị chính : (1) Quy tế đ nh nên tính đ c hi u c a thị ặ ệ ủ ử nghi m, vìệ n uế đo n m iạ ồ được ch nọ
càng đ c hi u cho chu iặ ệ ỗ đích, nghĩa là chỉ cĩ thể b t c p trên chu iắ ặ ỗ đích mà khơng thể b t c pắ ặ được trên các chu i DNA khác ngồi chu iỗ ỗ đích, thì s n ph m PCR càngả ẩ đ c hi u vàặ ệ thử nghi m PCR càngệ đ c hi u. (2)ặ ệ
Kh iở đ ng men polymerase vìộ men polymerase chỉ cĩ thể b tắ đ u t ngầ ổ
h p s i bợ ợ ổ sung cho chu i DNAỗ đích m t khi nĩộ nh n d ngậ ạ được đ uầ
3’ (là đ u màầ nĩ xúc tác cho m t dNTPộ được g n vào)ắ đang ở tình tr ngạ
s iợ đơi
5. Enzim DNA polymerase (Taq)
Là enzim xúc tác cho quá trình l p ráp các nucleotideắ A, T, G, C vào m ch DNA m i t ng h p, ph i làạ ớ ổ ợ ả men polymerase ch uị được nhi tệ độ cao.
Vào th p niên 1960, nhàậ Vi sinh v t h c Thomas Brockậ ọ đã đ n Cơngế
viên Qu c gia Yellowstone (Bang Wyoming, Mỹ)ố để nghiên c u các vi sinhứ
v tậ a nhi t s ng trong su i nư ệ ố ố ước nĩng 80-900C. Ơng đã phát hi n m tệ ộ
lồi vi khu n phát tri n m nhẩ ể ạ ở nhi tệ độ cao, cĩ tên là Thermus aquaticus. Hai mươi năm sau, các nhà khoa h c c a t pọ ủ ậ đồn Cetus (T pậ đồn Cơng nghệ Sinh h c California) đã nh n th y r ng DNA polymerase tọ ậ ấ ằ ừ Thermus
aquaticus (Taq-polymerase) cĩ khả năng gi i quy t v nả ế ấ đề c a enzim bi nủ ế
tính sau m i chu kỳ. DNA polymerase ch u nhi t sỗ ị ệ ử d ng cho ph nụ ả ngứ
PCR l nầ đ u tiênầ được bán trên thị trường là Taq-polymerase. Từ đĩ đ nế
nay, m t sộ ố vi sinh v t ch u nhi t khácậ ị ệ đã được khám phá và người ta đã tách chi t thêmế được các DNA polymerase ch u nhi tị ệ để sử d ng choụ
ph nả ng PCR nhứ ư Vent– polymerase (Tli-polymerase), Pfu–
6. DNA m u (DNA template)ẫ là m u DNA màẫ chúng ta sẽ khu chế đ i. Cĩạ thể là DNA kép, đ n, ho c RNAơ ặ được tách chi tế
từ các đ i tố ượng nghiên c u. DNA khuơn cĩứ độ nguyên v n cao tránh l nẹ ẫ
t p ch t.ạ ấ
VII. Chu kỳ nhi tệ
Cĩ 3 giai đo n chính trong ph nạ ả ng PCR vàứ chúng đượ ặc l p đi l pặ
l i nhi u l n (chu kỳ) (thạ ề ầ ường từ 25 đ n 75 chu kỳ).ế
* Giai đo n bi n tínhạ ế (denaturation): tách chu i DNA tỗ ừ s iợ đơi tách thành 2 s iợ đ n. Nhi tơ ệ độ tăng lên 94-96°C để tách hai s i DNA ra.ợ
Bước này g i làọ bi n tính, nhi tế ệ độ tăng lên sẽ phá vỡ c u n i hydrogenầ ố
c a chu i DNA. Trủ ỗ ước chu kỳ 1, DNA thường được bi n tínhế đ n th i gianế ờ
mở chu iỗ để đ m b o m u DNA vàả ả ẫ m iồ được phân tách hồn tồn và chỉ cịn d ng s iạ ợ đ n. Th i gianơ ờ ở giai đo n này kho ng : 1-2 phút.ạ ả
* Giai đo n b t c pạ ắ ặ (annealing): g n c p m iắ ặ ồ đ c tr ng theoặ ư
nguyên t c bắ ổ sung. Sau khi 2 s i DNA tách ra, nhi tợ ệ độ được hạ xu ngố để m i cĩồ thể g n vào s i DNAắ ợ đ n. Nhi tơ ệ độ giai đo n nàyạ
phụ thu c vàoộ đo n m i vàạ ồ thường th p h n nhi tấ ơ ệ độ bi n tính kho ngế ả
45-60°C. Sử d ng sai nhi tụ ệ độ trong giai đo n này d nạ ẫ đ n vi cế ệ đo n m iạ ồ
khơng g n hồn tồn vào DNA m u, hay g n m t cách tùy ti n. Th i gianắ ẫ ắ ộ ệ ờ
b t c p tắ ặ ừ 1-2phút.
* Giai đo n kéo dàiạ (extension): t ng h p chu i DNA m i gi ngổ ợ ỗ ớ ố
chu i DNA g c. DNA polymerase g n ti p vào s i tr ng. Nĩỗ ố ắ ế ợ ố b tắ đ u bámầ
vào và ho tạ đ ng d c theo s i DNA. Nhi tộ ọ ợ ệ độ kéo dài phụ thu c DNA-ộ
polymerase. Th i gian c a bờ ủ ước này phụ thu c vào cộ ả DNA-polymerase
và chi u dài m nh DNA c n khu chề ả ầ ế đ i. Nhạ ư m t quy t c 1000bp/ 1 phút .ộ ắ
Các đo n DNA m iạ ớ được hình thành l iạ được sử làm khuơn để t ngổ
h p cho các chu kỳợ ti p theo.ế
Như v y sậ ố lượng b n sao sẽả tăng g p 2 sau m i chu kỳấ ỗ và sau n chu kỳ, tính theo lý thuy t sế ố lượng b n sao làả 2n