CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Thẩm định quy trình định lượng cefixim bằng quang phổ UV
2.2.1.1. Chuẩn bị mẫu
Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 55,95 mg cefixim trihydrat (tương đương
50,0 mg cefixim) cho vào bình định mức 200 mL. Thêm khoảng 100 mL đệm phosphat pH 7,2; siêu âm 20 phút đến tan hoàn toàn. Thêm đệm phosphat pH 7,2 đến vạch, lọc
Dung dịch chuẩn: Lấy chính xác 2 mL dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 50
mL, thêm đệm phosphat pH 7,2 đến vạch. Lắc đều, thu được dung dịch cefixim có nồng độ 10 μg/mL
Dung dịch thử: Cân 20 viên thuốc thử, tính khối lượng trung bình và nghiền thành bột
mịn. Cân chính xác khoảng một lượng bột tương ứng với 50,0 mg cefixim cho vào bình định mức 200 mL. Thêm khoảng 100 mL HCl 0,1 N, siêu âm 20 phút đến tan hoàn toàn. Thêm đệm phosphat pH 7,2 đến vạch, lọc. Lấy chính xác 2 mL dịch lọc cho vào bình định mức 50 mL, thêm đệm phosphat pH 7,2 đến vạch, lắc đều, thu được dung dịch thử có nồng độ 10 μg/mL
Dung dịch placebo: Cân chính xác khoảng một lượng bột placebo tương ứng lượng tá
dược trong viên nén phân tán trong miệng chứa 50,0 mg cefixim cho vào bình định mức 200 mL. Thêm khoảng 100 mL đệm phosphat pH 7,2; siêu âm 20 phút. Thêm đệm phosphat pH 7,2 đến vạch; lọc. Lấy chính xác 2 mL dịch lọc cho vào bình định mức 50 mL, thêm đệm phosphat pH 7,2 đến vạch, lắc đều, thu được dung dịch placebo
Điều kiện tiến hành:
Đo độ hấp thụ UV của các dung dịch tại bước sóng 288 nm bằng cốc đo thạch anh, sử dụng mẫu trắng là dung dịch đệm phosphat pH 7,2
Cơng thức tính hàm lượng cefixim trong mẫu viên: X (%) = AT × Dt × mc × mtb
Ac × Dc × p × L × 100 Trong đó:
X : Hàm lượng cefixim (%)
AT : Độ hấp thụ của dung dịch thử Ac : Độ hấp thụ của dung dịch chuẩn
20 Dt : Độ pha loãng của dung dịch thử
Dc : Độ pha loãng của dung dịch chuẩn mc : Khối lượng cân chuẩn (mg)
mtb : Khối lượng trung bình của một viên (mg) p : Khối lượng cân của mẫu thử (mg)
L : Hàm lượng ghi trên nhãn (mg)
2.2.1.2. Thẩm định quy trình định lượng cefixim
Tính đặc hiệu
Mục đích: đánh giá ảnh hưởng của tá dươc̣ lên độ hấp thụ của cefixim.
Tiến hành: Quét phổ UV xác định bước sóng hấp thụ cực đại của các dung dịch mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu placebo trong khoảng bước sóng 200 - 400 nm và ghi nhận kết quả
Yêu cầu: Bước sóng được lựa chọn khi phổ UV của mẫu thử có bước sóng hấp thụ cực đại tương tự bước sóng hấp thụ cực đại của mẫu chuẩn, mẫu trắng và mẫu placebo khơng có đỉnh hấp thụ tại bước sóng này
Tính tuyến tính
Ngun tắc: tính tuyến tính được xác định bằng cách đo độ hấp thụ những mẫu dung dic̣h chuẩn có nồng độ khác nhau bằng phương pháp đo quang phổ UV ở bước sóng 288 nm.
Tiến hành: pha giai mẫu chuẩn có dãy nồng độ tăng dần như được trình bày trong bảng 2.6.
21
Bảng 2.6. Giai mẫu chuẩn có dãy nồng độ tăng dần
Nồng độ (μg/mL) 2 5 10 16 20 Thể tích dung dịch gốc 1 5 10 4 10 Nước cất vừa đủ (mL) 50 100 100 25 50 Yêu cầu:
- Xây dựng phương trình hồi quy giữa nồng độ và độ hấp thụ của cefixim với bình phương hệ số tương quan R2 ≥ 0,99
- Sử dụng “phân tích hồi quy” với trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy và trắc nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp của phương trình hồi quy
Trắc nghiệm F (Phân phối Fisher)
Giả thuyết: H0: Bj = 0 “Phương trình hồi quy khơng tương thích” HA: Bj = 0 “Phương trình hồi quy tương thích” Nếu p > 0,05 => chấp nhận giả thuyết H0
Nếu p < 0,05 => chấp nhận giả thuyết HA Trắc nghiệm t (Phân phối Student)
Giả thuyết H0: Bj = 0 “Hệ số Bj khơng có ý nghĩa thống kê” HA: Bj = 0 “Hệ số Bj có ý nghĩa thống kê” Nếu p > 0,05 => chấp nhận giả thuyết H0
Nếu p < 0,05 => chấp nhận giả thuyết HA
Độ chính xác
Đo độ hấp thụ của 6 mẫu thử. Tính RSD (%) của hàm lượng cefixim trong 6 mẫu thử Yêu cầu: RSD ≤ 2%
22
Độ đúng
Cách tiến hành: Thêm vào mẫu placebo một lượng cefixim chuẩn tương ứng với 80%, 100%, 120% hàm lượng cefixim trong mẫu thử. Mỗi nồng độ thực hiện với 3 mẫu, đo độ hấp thụ ở bước sóng 288 nm và xác định tỷ lệ phục hồi
Tỷ lệ phục hồi được tính theo cơng thức:
F (%) = Lượng cefixim tìm lại (mg)
Lượng cefixim được thêm vào (mg) × 100
Yêu cầu: Tỷ lệ hồi phục F của từng mẫu thử phải nằm trong khoảngg 98 - 102%.
2.2.2. Xây dựng công thức viên nén phân tán trong miệng cefixim 100 mg
2.2.2.1. Phương pháp bào chế viên nén phân tán trong miệng
Cefixim trihydrat là một kháng sinh thuộc nhóm cephalosporin thế hệ 3. Một số nghiên cứu về độ ổn định cho thấy cefixim trihydrat bị thủy giải trong môi trường acid, kiềm và nước [29, 30]. Do đó, phương pháp dập thẳng được lựa chọn trong bào chế viên nén phân tán trong miệng chứa cefixim 100 mg
Quy trình bào chế viên nén phân tán trong miệng cefixim 100 mg được tiến hành như sau:
- Cân, rây Cefixim trihydrat, tá dược độn, tá dược rã, aspartam và hương cam qua rây 0,5 mm
- Trộn cefixim trihydrat, tá dược độn trong 5 phút (Hỗn hợp 1) - Trộn hỗn hợp 1 với tá dược rã trong 5 phút (hỗn hợp 2)
- Trộn hỗn hợp 2 với aspartam và hương cam trong 5 phút (hỗn hợp 3) - Cân, rây tá dược trơn qua rây 0,3 mm
- Trộn hỗn hợp 3 với tá dược trơn trong 3 phút (hỗn hợp 4)
- Dập viên bằng máy dập viên xoay tròn, khối lượng 1000 mg ± 5%, đường kính 16 mm. Độ cứng khoảng 50 ± 10 N
Quy trình điều chế viên nén phân tán trong miệng chứa cefixim 100 mg được trình bày trong hình 2.4.
23
Hình 2.4. Lưu đồ tổng quát bào chế viên nén phân tán trong miệng cefixim 100 mg
2.2.2.2. Phương pháp đánh giá các chỉ tiêu chất lượng của bột trước khi dập viên
Bột trộn hoàn tất được đánh giá các chỉ tiêu chất lượng bao gồm tỷ trọng khối, tỷ trọng gõ, Carr's index và tỷ số Hausner
Cách tiến hành: Cân khoảng 30g cốm cho vào ống đong 100 mL, thả nhẹ cho ống đong rơi tự do 3 lần cách mặt bàn 2 cm, ghi thể tích V1. Đưa ống đong lên máy đo tỷ trọng hạt tiến hành gõ trên máy với tần suất 250 lần/phút. Điểm dừng của thử nghiệm được xác định là 2 phút, đọc thể tích V2
24 Tỷ trọng khối được xác định bằng công thức:
Db = m V1 Tỷ trọng gõ được xác định bằng công thức:
Dt = m V2
Chỉ số nén (Carr's index) được xác định bằng công thức: Carr's index = Dt - Db
Dt × 100 Tỷ số Hausner được xác định bằng cơng thức:
Tỷ số Hausner = Dt Db Trong đó
m : Khối lượng cân (g)
V1 : Thể tích của mẫu thử sau khi gõ nhẹ 3 lần (mL) V2 : Thể tích của mẫu thử sau khi gõ bằng máy (mL) Db : Tỷ trọng khối của mẫu thử
Dt : Tỷ trọng gõ của mẫu thử
25
Bảng 2.7. Tiêu chuẩn đánh giá độ trơn chảy bằng Carr’s index và tỷ số Hausner
Chỉ số nén (%) Tỷ số Hausner Độ trơn chảy
< 10 1,00 – 1,11 Rất tốt 11 – 15 1,12 – 1,18 Tốt 16-20 1,19 – 1,25 Khá 21 – 25 1,26 – 1,34 Trung Bình 26 – 31 1,35 – 1,45 Kém > 32 1,46 – 1,59 Rất kém
2.2.2.3. Phương pháp đánh giá các chỉ tiêu chất lượng của viên nén phân tán trong miệng
Viên nén phân tán trong miệng được đánh giá các chỉ tiêu chất lượng bao gồm cảm quan, độ cứng, độ mài mòn, độ rã, độ hoà tan, độ đồng đều phân tán, thời gian phân tán, thời gian thấm ướt, tỷ lệ hút nước
Cảm quan
Viên nén tạo thành có hình trịn, màu vàng nhạt, hai mặt khum lồi, không bị mẻ cạnh.
Độ đồng đều khối lượng
Tiến hành thử độ đồng đều khối lượng theo chuyên luận phép thử độ đồng đều khối lượng của DĐVN V (Phụ lục 11.3)
Cân riêng biệt 20 viên nén ngẫu nhiên, tính khối lượng trung bình
u cầu: Khơng được có q hai đơn vị có khối lượng nằm ngồi giới hạn ± 5% so với khối lượng trung bình và khơng được có đơn vị nào có khối lượng vượt gấp đơi giới hạn
Độ cứng
Đo độ cứng riêng biệt 10 viên, tính độ cứng trung bình và độ lệch chuẩn tương đối.
Độ mài mòn
Cân một lượng mẫu thử ít nhất 6,5 g viên nén (đã được làm sạch bụi trước đó) cho vào trống quay của máy thử mài mòn, tốc độ quay 25 vòng/phút, thời gian 4 phút
26
Sau khi thử, viên được lấy ra làm sạch bụi trên bề mặt, cân lại khối lượng và tính độ mài mịn theo cơng thức sau:
F (%) = m1 - m2
m1 × 100 Trong đó:
m1 : Khối lượng viên ban đầu (g) m2: Khối lượng viên sau khi thử (g) Yêu cầu: Độ mài mòn < 1%
Độ hòa tan
Viên nén phân tán trong miệng khi vào dung mơi thử độ hồ tan sẽ phân tán thành hỗn dịch nên độ hoà tan của viên nén phân tán trong miệng sẽ được thử theo dạng bột pha hỗn dịch. Đánh giá độ hòa tan của bột pha hỗn dịch tiến thành được tiến hành trên 4 mẫu, tham khảo phương pháp thử độ hòa tan của Cơ quan quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) đối với bột pha hỗn dịch chứa cefixim trihydrat theo các điều kiện [31] - Thiết bị: kiểu cánh khuấy
- Môi trường: 900 mL đệm phosphat pH 7,2 - Tốc độ: 50 vòng/phút
- Nhiệt độ: 37 ± 0,5 °C
- Thời gian lấy mẫu: 10, 20, 30, 45 phút - Thể tích lấy mẫu: 10 mL
Cách tiến hành: Cho mẫu vào từng bình thử hịa tan, sau mỗi thời điểm 10, 20, 30, 45 phút rút 10 mL dung dịch thử. Tiến hành lọc ngay qua màng lọc 0,45 μm và bổ sung bằng 10 mL dung dịch đệm phosphat pH 7,2. Mẫu thử sau đó được pha lỗng trong bình định mức 25 mL và tiến hành đo độ hấp thụ tại bước sóng 288 nm.
Nồng độ mẫu thử tại từng thời điểm lấy mẫu được xác định bằng công thức: Ci = AT × CC× d
AC
Phần trăm phóng thích hoạt chất tại từng thời điểm lấy mẫu được xác định bằng cơng thức
27 % GPHC = (Vmt × Ci + ∑Cj-1× Vt) i j=1 × 100 L Trong đó:
Ci : Nồng độ mẫu thử tai thời điểm i (mg/mL) AT : Độ hấp thụ của dung dịch thử
AC : Độ hấp thụ của dung dịch chuẩn d : Hệ số pha lỗng mẫu thử
Vmt : Thể tích mơi trường thử hịa tan (mL) L : Hàm lượng cefixim ghi trên nhãn (mg)
Vt : Thể tích mẫu thử được rút tại mỗi thời điểm lấy mẫu (mL)
Định lượng
Viên nén phân tán trong miệng được tiến hành định lượng bằng phương pháp quang phổ UV
Chuẩn bị mẫu:
Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 55,95 mg Cefixim trihydrat (tương đương
50,0 mg cefditoren) vào bình định mức 200 mL. Thêm khoảng 100 mL dung dịch đệm phosphat pH 7,2, siêu âm 20 phút đến tan hoàn toàn. Thêm dung dịch đệm phosphat pH 7,2 đến vạch, lọc
Dung dịch chuẩn: Lấy chính xác 2 mL dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 50
mL, thêm dung dịch đệm phosphat pH 7,2 đến vạch. Lắc đều, thu được dung dịch cefixim có nồng độ khoảng 10 μg/mL
Dung dịch thử: Cân 20 viên thuốc thử, tính khối lượng trung bình và nghiền thành bột
mịn. Cân chính xác khoảng một lượng bột tương ứng với 50,0 mg cefditoren cho vào bình định mức 200 mL. Thêm khoảng 100 mL dung dịch đệm phosphat pH 7,2, siêu âm 20 phút đến tan hoàn toàn. Thêm dung dịch đệm phosphat pH 7,2 đến vạch, lọc. Lấy chính xác 2 mL dịch lọc cho vào bình định mức 50 mL, thêm dung dịch đệm phosphat pH 7,2 đến vạch, lắc đều, thu được dung dịch thử có nồng độ khoảng 10 μg/mL
Cách tiến hành: Đo độ hấp thụ của dung dịch chuẩn và dung dịch thử tại bước sóng 288 nm, sử dụng mẫu trắng là dung dịch đệm phosphat pH 7,2
28
Độ rã
Tiến hành thử độ rã theo chuyên luận phép thử độ rã của viên nén, DĐVN V (Phụ lục 11.6) trên máy thử độ rã ERWEKA ZT 31, thực hiện trong môi trường nước, nhiệt độ trong khoảng 15 - 25 °C. Thử với 6 viên ngẫu nhiên và giá trị trung bình.
Yêu cầu: Viên nén phân tán trong miệng phải rã trong thời gian không quá 180 giây.
Độ đồng đều phân tán
Cho 2 viên vào 100 mL nước, khuấy đến khi phân tán hoàn toàn. Độ phân tán đạt yêu cầu khi dịch phân tán chảy hết qua lỗ mắt rây 710 µm.
Thời gian phân tán
Mỗi viên được thả vào becher có chứa sẵn 10 mL nước cất. Thời gian phân tán của viên được tính từ khi bắt đầu cho viên vào nước đến khi viên rã thành từng mảnh nhỏ. Thử với 3 viên ngẫu nhiên và tính giá trị trung bình.
Yêu cầu: Thời gian phân tán không quá 180 giây
Thời gian thấm ướt
Cho 10 mL nước cất vào đĩa petri đường kính 10 cm. Cẩn thận đặt viên nén vào giữa đĩa. Thời gian để nước thấm lên bề mặt trên của viên nén được tính là thời gian thấm ướt. Thử với 3 viên ngẫu nhiên và tính giá trị trung bình.
u cầu: Thời gian thấm ướt của viên không quá 180 giây.
Tỷ lệ hút nước
Đặt một tờ giấy mềm đã được gấp tư vào đĩa petri rồi đặt lên đĩa cân. Sau đó, đặt viên vào đĩa và xác định khối lượng ban đầu của viên. Nhỏ từ từ từng giọt nước cất lên viên cho tới khi viên được thấm ướt hoàn toàn. Xác định khối lượng viên và tính tỷ lệ hút nước.
Tỷ lệ hút nước được tính theo cơng thức:
R (%) = Wa - Wb
Wb × 100 Trong đó
R : Tỷ lệ hút nước (%)
29 Wb: Khối lượng viên trước khi hút nước (mg)
Tiến hành thử với 3 viên ngẫu nhiên và tính giá trị trung bình