1.2. TỔNG QUAN VỀ ĐA HÌNH GEN TY THỂ
1.2.2. DNA ty thể trong nghiên cứu quan hệ di truyền người
Ty thể là bào quan nằm trong tế bào chất của tế bào. Chức năng chủ yếu của ty thể là tạo ra ATP - năng lượng thiết yếu cho các hoạt động của tế
bào. Do đó, phụ thuộc vào nhu cầu năng lượng, mỗi tế bào có từ hàng trăm đến hàng ngàn ty thể tùy thuộc vào từng loại tế bào và từng loại mơ. Ty thể có cấu trúc màng kép, bao gồm lớp màng ngồi có tính thấm cao với các kênh vận chuyển (porin) nằm xung quanh khoảng không gian giữa 2 lớp màng và lớp màng bên trong khơng có tính thấm. Màng trong của ty thể tạo thành các mào (cristae) và chứa các chuỗi vận chuyển điện tử của ty thể. Phần chất nền bên trong chứa các phân tử ribosome và ADN của ty thể [54].
Hình 1.1. Cấu tạo ty thể người
Nguồn: Wang H. và cộng sự (2021) [54]
Hệ gen ty thể người là phân tử mạch kép, vịng và khơng liên kết với protein histon. Mỗi ty thể có từ 2 đến 10 bản sao DNA và tính trên một tế bào con số ấy lên tới hàng trăm, hàng nghìn [55]. Kích thước của chúng là 16569 bp, tuy nhiên có thể sai khác đơi chút do có những đoạn chèn vào, hoặc do mất đoạn, hoặc có những trình tự lặp lại nối tiếp. Người ta đã đưa ra nhiều giả thuyết về nguồn gốc tiến hoá của hệ gen ty thể. Giả thuyết được chấp nhận rộng rãi nhất là hệ gen ty thể là dấu vết còn lại của hệ gen vi khuẩn cổ, sống cộng sinh bên trong tế bào sinh vật nhân chuẩn [56].
Cấu trúc phân tử DNA ty thể người gồm có hai chuỗi: chuỗi nặng giàu
Guanine và chuỗi nhẹ giàu Cytosine, có 37 gen mã hóa cho 2 rRNA (12S và
16S), 22 tRNA và 13 protein. 13 chuỗi polypeptide được mã hóa bởi DNA ty thể là thành phần của phức hệ hô hấp của ty thể, trong đó có 7 tiểu phần (ND1, 2, 3, 4L, 4, 5, 6) trong số 46 chuỗi polypepetide của phức hệ I (NADH dehydrogenase), 1 tiểu phần (cytochrome b, Cytb) trong số 11 chuỗi
polypeptide của phức hệ III (Phức hệ bc1), 3 tiểu phần (CO I, II, III) trong số 13 polypeptide của phức hệ IV (cytochrome c oxidase) và 2 tiểu phần (ATPase 6 & 8) trong số 16 protein của phức hệ V (ATP synthase) [57]. Các protein khác của ty thể bao gồm tất cả 4 tiểu đơn vị của phức hệ II (succinate
dehydrogenase), tiểu đơn vị DNA polymerase của ty thể, các thành phần của
RNA polymerase của ty thể, yếu tố phiên mã của ty thể (mtTFA), các protein ribosome của ty thể, các yếu tố kéo dài chuỗi và các enzyme trao đổi chất của ty thể đều được mã hóa bởi DNA nhân [58].
Hình 1.2. Cấu trúc phân tử DNA ty thể người
* Đặc điểm di truyền và ứng dụng của DNA ty thể trong nghiên cứu quan hệ di truyền người
Nghiên cứu di truyền quần thể và tiến hóa ở các sinh vật nói chung và ở người nói riêng ln cần những cơng cụ mạnh, cho kết quả nhanh và chính xác. Từ những nghiên cứu đầu tiên sử dụng các chỉ thị nhóm máu ABO, rồi đến các chỉ thị là những gen trong nhân, đặc biệt là các gen liên quan đến miễn dịch như hệ thống gen HLA đã cho một số kết quả nhất định trong các nghiên cứu về đa dạng di truyền [60]. Tuy nhiên, việc sử dụng các gen trong nhân làm đối tượng nghiên cứu lại có một số nhược điểm. Gen nhân có tần số đột biến thấp, mặt khác chúng lại được di truyền từ cả bố và mẹ và bị phân ly qua mỗi thế hệ nên việc dị tìm tổ tiên và mối quan hệ di truyền của đoạn DNA nào đó trở nên rất khó khăn. Bởi vậy DNA ty thể với lợi thế tần số đột biến cao sẽ là công cụ hữu hiệu trong các nghiên cứu về di truyền quần thể [61].
Sự di truyền của DNA ty thể là sự di truyền tế bào chất. Đối với các gen nằm trong nhân của tế bào sinh vật nhân chuẩn, chúng tuân theo các quy luật vận động của nhiễm sắc thể trong các cơ chế phân bào. Nhưng hệ gen ty thể lại khơng tn theo những quy luật đó mà các tính trạng do chúng xác định có những kiểu di truyền riêng đặc trưng cho chúng và chính những đặc điểm di truyền này đã trở thành thế mạnh khiến DNA ty thể nhanh chóng trở thành đối tượng được nghiên cứu rộng rãi.
- Số lượng lớn: Hệ gen ty thể có rất nhiều bản sao trong một tế bào. Nếu như mỗi gen hay đoạn DNA trong nhân chỉ có 2 bản sao ở 2 nhiễm sắc thể tương đồng thì với hệ gen ty thể con số đó là hàng trăm tới hàng nghìn bản sao. Đặc điểm này cùng với việc DNA ty thể tồn tại ở dạng vòng và nằm trong tế bào chất nên việc tách chiết, thu nhận DNA ty thể dễ dàng hơn. Điều này đặc biệt có ý nghĩa trong trường hợp phân tích những mẫu sinh phẩm cịn sót lại sau hàng chục hay hàng trăm năm. DNA nhân do có cấu trúc mạch thẳng nên khơng bền, dễ bị phân huỷ, làm cho việc phân tích gặp nhiều khó
khăn. Trong khi đó, DNA ty thể mạch vịng, có kích thước nhỏ nên bền theo thời gian trong các mơ khó phân huỷ như mơ xương, răng và tóc.
- Di truyền theo dịng mẹ: ở động vật có vú, DNA ty thể được di truyền theo dòng mẹ [62]. Số lượng DNA ty thể ở noãn bào khoảng hơn 100.000 phân tử trong khi tinh trùng chỉ có từ 100 đến 1500 phân tử. Trong q trình tạo thành hợp tử, tế bào tinh trùng chỉ đóng góp hệ gen nhân của chúng cho tế bào trứng chứ khơng đóng góp hệ gen ty thể. Ty thể của tinh trùng bị loại bỏ ngay khi vào trứng có thể do q trình phân hủy protein phụ thuộc ubiquitin [63]. Do vậy, các cá thể cùng mẹ hoặc liên quan theo dòng mẹ chứa các bản sao DNA ty thể gần như giống nhau. Đặc tính này giúp cho việc tìm kiếm các dịng giống có quan hệ với nhau theo thời gian và tìm kiếm tổ tiên chung của một quần thể. Tuy nhiên, đôi khi cơ chế loại bỏ DNA ty thể của tinh trùng có thể bị hỏng, dẫn đến hiện tượng tế bào chất của hợp tử chứa nhiều loại DNA ty thể. Hiện tượng này được gọi là hiện tượng “dị tế bào chất” (heteroplasmy). - Đơn bội, khơng có sự tái tổ hợp, mặc dù enzyme tái tổ hợp ở ty thể có thể có chức năng. Nhìn chung hiện tượng tái tổ hợp là rất hiếm gặp và khơng đáng kể. Và do đó nếu khơng có mặt của các phân tử DNA dị tế bào chất thì các phân tử DNA ty thể của hợp tử không khác so với phân tử DNA ty thể ban đầu [64].
- Tốc độ đột biến lớn: Tốc độ đột biến thay thế trong hệ gen ty thể gấp khoảng 10 - 100 lần tốc độ đột biến trung bình của DNA nhân [65], [66]. Tốc độ đột biến của vùng điều khiển cao hơn vùng mã hóa, đặc biệt cao nhất ở 2 vùng siêu biến HV1 và HV2 [67]. Tốc độ đột biến này có thể là do trong q trình sao chép mắc nhiều lỗi và ty thể thiếu cơ chế để sửa chữa các sai hỏng như ở gen nhân [68]. Mặt khác, ty thể là nơi ln diễn ra các q trình oxy hóa và do đó, sản sinh ra các chất oxy hóa mạnh như các gốc tự do. Các chất này sẽ tác động đến hệ gen của ty thể và phát sinh ra các đột biến. Do các đột biến là ngẫu nhiên nên bất kỳ bazơ nào trong hệ gen ty thể, cả ở vùng mã hóa
và khơng mã hóa, đều có thể bị thay đổi. Hơn nữa do các tế bào đều có hàng trăm đến hàng nghìn DNA ty thể nên các đột biến DNA ty thể có hại có thể xảy ra ở tất cả các mô, sinh dưỡng và sinh dục. Các đột biến bắt nguồn ở các mô sinh dưỡng (somatic tissue) làm giảm việc sản xuất năng lượng cho tế bào và những người bị các đột biến này thường sẽ chết. Còn các đột biến bắt nguồn từ tế bào sinh dục của mẹ và được truyền cho thế hệ sau thì được xem là các đa hình DNA ty thể [50].
Nhờ đặc tính chọn lọc vơ tính hoặc gần như vơ tính nên các dạng DNA ty thể khác nhau khơng bị loại bỏ trong q trình chọn lọc và do đó chúng trở nên phổ biến do sự trơi dạt di truyền. Do DNA ty thể được di truyền theo mẫu hệ nên nó tích luỹ các đột biến và phát tán theo các dịng phả hệ mẫu hệ. Chính điều này đã tạo nên tính đa hình của DNA ty thể, đặc trưng theo quần thể, tạo nên các nhóm kiểu đơn của DNA ty thể có quan hệ với nhau, hay cịn gọi là nhóm đơn bội (Haplogroup).
Từ các nghiên cứu đầu tiên về đa hình DNA ty thể người sử dụng kỹ thuật RFLP và trình tự đoạn siêu biến trên vùng điều khiển D-loop của DNA ty thể, người ta thấy rằng các loại DNA ty thể khác nhau có thể xếp vào các nhóm đơn bội khác nhau dựa trên sự có mặt và vắng mặt các băng khi cắt DNA ty thể bằng một enzyme giới hạn nào đó và dựa trên trình tự đặc trưng của vùng điều khiển. Theo đó mỗi nhóm đơn bội có một bộ các đa hình
nucleotide đơn (Single Nucleotide Polymorphisms – SNPs) đặc trưng và
thường đi kèm với nhóm đơn bội đó. Việc phân loại và sắp xếp các nhóm đơn bội sẽ giúp phân tích các dịng DNA ty thể theo phả hệ, từ đó có thể dựng lại q trình tiến hóa và nghiên cứu mối quan hệ di truyền của người. Dựa trên số liệu RFLP người ta đã phân loại DNA ty thể thành 4 nhóm đơn bội đối với người Phi là L0, L1, L2 và L3. Ba nhóm L0, L1, L2 chiếm 76% dân số Châu Phi và được đặc trưng bởi điểm cắt giới hạn HpaI ở vị trí 3592. Ở Đơng Bắc Phi, 2 dòng DNA ty thể M và N xuất hiện từ nhóm L3 khoảng 65.000 năm
trước đây và là tổ tiên của tất cả các dòng DNA ty thể trên lục địa Á, Âu. Ở Châu Âu, nhóm L3 và N tạo nên 9 nhóm đơn bội là H, I, J, K, T, U, V, W, X. Ở Châu Á, 2 nhóm đơn bội lớn là M và N phân li tạo nên các nhóm đơn bội nhỏ hơn. Từ N tạo nên các nhóm A, B, F và các nhóm khác; từ M phân chia thành các nhóm C, D, G và các nhóm khác [69].
Cùng với sự phát triển của phương pháp PCR và phương pháp xác định trình tự DNA tự động, việc phân tích DNA ty thể hiện nay khơng cịn dựa nhiều vào kỹ thuật RFLP nữa mà chủ yếu dựa trên các trình tự của DNA ty thể, đặc biệt là vùng điều khiển D-loop. Việc nghiên cứu hệ gen ty thể, đọc trình tự nucleotide của các vùng siêu biến của đoạn D-loop cũng như các gen chức năng khác của ty thể, dẫn đến giải mã toàn bộ hệ gen ty thể của nhiều đại diện dân tộc khác nhau sẽ cung cấp số liệu để phân loại các nhóm đơn bội chính xác và chi tiết hơn [70]. Ngồi ra, đặc điểm di truyền ty thể người cũng tỏ ra hữu ích cho các nghiên cứu pháp y và nhận dạng con người [71].
* Vùng điều khiển (D-loop) ở DNA ty thể - Cấu trúc vùng D-loop
Ở động vật có vú, vùng điều khiển của DNA ty thể, hay còn gọi là vùng D-loop, là vùng điều hịa chính và là vùng duy nhất trong hệ gen ty thể khơng mã hóa protein. Vùng này chứa các điểm khởi đầu sao chép của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ và chứa promoter cho sự phiên mã chuỗi nặng và chuỗi nhẹ.
Ở người, vùng D-loop có chiều dài khoảng 1,1 kb, nằm từ vị trí 16024 - 16569/0 - 576 và giữa hai gen tRNA vận chuyển cho acid amin Phenylalanin và Prolin. Do khơng mang các gen mã hóa protein nên các đột biến trung tính xảy ra nhiều và có thể nói là cao nhất so với tồn bộ hệ gen ty thể, cao hơn các vùng khác từ 1,8 lần đến 4,4 lần [72] [73], [74].
Năm 1983, Greenberg B.D. và cộng sự [75] đã xác định được hai đoạn DNA trong vùng D-loop có tần số đột biến cao nhất được gọi là vùng siêu biến 1 (HV1 - Hypervariable region) (có kích thước 359 bp, nằm ở vị trí
16024 - 16365) và vùng siêu biến 2 (HV2) (có kích thước 325 bp, nằm ở vị trí 57 - 372). Theo Vanecek T. và cộng sự [76] cịn có một trình tự và một vùng siêu biến HV3 với các trình tự lặp lại 2 nucleotide CA. Cấu trúc của vùng điều khiển D-loop được thể hiện ở hình 1.3.
Hình 1.3. Cấu trúc của vùng điều khiển D-loop
* Nguồn: Falah M. và cộng sự (2017) [77]
Trình tự hồn chỉnh vùng D-loop của nhiều dân tộc thuộc các châu lục trên thế giới đã được công bố trong ngân hàng dữ liệu gen quốc tế về DNA ty thể (http://www.mitomap.org). Đã có nhiều trình tự vùng D-loop đã được cơng bố, trong đó có 101 trình tự hồn chỉnh của hệ gen ty thể người thuộc các chủng tộc người khác nhau được nghiên cứu và đăng ký [78]. Tuy nhiên, với tần số đột biến cao, nhiều điểm đa hình nên hai vùng siêu biến HV1 và HV2 được tập trung nghiên cứu hơn cả, đặc biệt là vùng siêu biến 1.
Ở một số cá thể, vùng siêu biến HV1 và HV2 có các đoạn lặp lại liên tiếp các nucleotide Cytosine, thường được gọi là các đoạn poly C. Ở vùng
HV1 (dài 359 bp), đoạn poly C nằm từ vị trí 16183 - 16193 còn ở vùng HV2 (dài 315 bp) đoạn poly C nằm từ vị trí 303 - 327. Ở trình tự tham chiếu CRS (trình tự hệ gen ty thể hồn chỉnh của người đầu tiên được Anderson và cộng sự công bố vào năm 1981), đoạn poly C của vùng HV1 được ngắt quãng bởi
nucleotide Thymine ở vị trí 16189, tuy nhiên rất nhiều trình tự DNA ty thể có
đột biến T16189C tạo thành chuỗi có 10 nucleotide Cytosine liên tiếp. Đột
biến T16189C được xem là có tốc độ đột biến cao nhất trong hệ gen ty thể người [79]. Nghiên cứu cho thấy có hiện tượng “dị tế bào chất” ở đoạn poly C này, tức là trong tế bào và cơ thể có nhiều loại DNA ty thể có chiều dài và trình tự đoạn poly C khác nhau. Điều này có thể là do sự dịch khung đọc trong quá trình sao chép DNA. Tỷ lệ phần trăm các phân tử DNA ty thể mang các độ dài đoạn poly C khác nhau là ổn định ở mỗi cá thể, được duy trì theo dịng mẹ và được tạo mới trong quá trình phát triển [80].
- Vùng D-loop của DNA ty thể trong nghiên cứu quan hệ di truyền người
Hầu hết các nghiên cứu về tiến hóa của người đều dựa trên việc giải trình tự DNA ty thể, đặc biệt là trình tự vùng điều khiển D-loop. Việc phân tích các đa hình di truyền trong các trình tự nucleotide của DNA ty thể đã làm sáng tỏ về tiến hóa của lồi người ở khía cạnh nguồn gốc của các quần thể người hiện đại và các mơ hình di cư của lồi người. Phân tích đa hình trình tự DNA ty thể để phân loại cá thể theo các nhóm đơn bội và dị tìm tổ tiên tập trung chủ yếu vào nghiên cứu trình tự vùng siêu biến 1 và 2, đặc biệt là vùng siêu biến 1. Điều này có được do tính đa hình rất lớn của đoạn HV1. Trong 419 trình tự nucleotide của đoạn HV1 có 275 ví trí nucleotide thay đổi, 188 vị trí mang 2 nucleotide khác nhau (164 vị trí là đồng hốn, 24 vị trí là dị hốn), 66 vị trí với 3 nucleotide và 21 vị trí có mặt cả 4 nucleotide [81].
Do tần số đột biến cao như vậy nên vùng điều khiển D-loop nói chung và hai đoạn siêu biến HV1 và HV2 nói riêng cũng thu hút sự tập trung nghiên cứu về mối liên hệ của nó với bệnh tật, đặc biệt là các bệnh ung thư, bệnh di
truyền, bệnh về cơ, thần kinh... Đa số các nghiên cứu cho thấy có mối liên hệ nhất định giữa các bệnh với trạng thái dị tế bào chất ở DNA ty thể của các bệnh nhân [82],[83]. Mặc dù các nghiên cứu về vùng siêu biến 2 được thực