4.1.1. Phản ứng tổng hợp 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin
Phản ứng giữa βCD với 1,2-propylen oxid trong môi trƣờng NaOH: xảy ra theo cơ chế SN2. Vòng epoxy mở ra theo hƣớng ít cản trở không gian nhất, do đó sản phẩm tạo thành chủ yếu là alcol bậc 2 (2-hydroxypropyl-).
Sơ đồ 4.1. Phản ứng của 1,2-propylen oxid trong môi trƣờng NaOH
Nồng độ NaOH: môi trƣờng phản ứng với nồng độ NaOH thấp phản ứng thế gốc 2-hydroxypropyl xảy ra chủ yếu ở vị trí OH-C-2 là nhóm OH cạnh gốc bán acetan có tính
acid mạnh nhất. Khi nồng độ NaOH tăng lên, ion Na+ có xu hƣớng kết hợp vào gốc O--C-2 làm phản ứng ở vị trí này giảm trong khi ở các nồng độ NaOH này chƣa đủ để
phản ứng ở OH bậc 1 tại C-6 xảy ra, do đó khi nồng độ NaOH tăng, hiệu suất, DS giảm và cả mô hình thay thế phân tử cũng bị ảnh hƣởng. Phản ứng ở OH-C-3 (là alcol bậc 2) ít bị ảnh hƣởng bởi nồng độ NaOH nên vẫn tiếp tục xảy ra.
Mục đích của phản ứng thế gốc 2-hydroxypropyl để phá vỡ liên kết hydro của các nhóm OH ở C-2 và C-3 của βCD làm tăng độ tan của sản phẩm tổng hợp, nên đề tài này chỉ giới hạn tổng hợp HPβCD ở môi trƣờng NaOH thấp (1,5%). Đây cũng là nồng độ NaOH mà tác giả Josef Pitha và cộng sự thực hiện trong nhiều nghiên cứu và đã đƣợc công bố [20], [24], [49].
Tỷ lệ các chất tham gia phản ứng: mức khởi đầu của phản ứng tổng hợp đƣợc tiến hành với tỷ lệ 1 mmol βCD và 8 mmol 1,2-propylen oxid nhằm mục đích phản ứng xảy ra cả ở OH-C-2 và OH-C-3 (1 phân tử βCD có 7 nhóm OH cạnh gốc bán acetan ở các vị trí C-2).
Phản ứng tạo tạp chất: trong môi trƣờng có nƣớc, 1,2-propylen oxid còn tự phản ứng tạo propylen glycol, dipropylen glycol, tripropylen glycol và các polyglycol cao phân tử khác.
Sơ đồ 4.2. Phản ứng của 1,2-propylen oxid trong nƣớc tạo các tạp chất.
Các tạp chất sinh ra trong phản ứng tổng hợp HPβCD đã đƣợc nhóm tác giả Josef Pitha và cộng sự nghiên cứu [50].
Để hạn chế phản ứng tạo tạp chất, 1,2-propylen oxid thêm vào bình phản ứng từng lƣợng nhỏ vừa đủ phản ứng với βCD.
Độ tinh khiết của HPβCD tổng hợp: trên phổ đồ HPLC, ngoài pic chính còn xuất hiện thêm 1 pic nhỏ đƣợc xác định là tạp, đây có thể là phần mà các đồng phân HPβCD có DS cao (phụ lục 4, hình PL. 4.10). Với phƣơng pháp HPLC dùng pha động là nƣớc, HPβCD có DS cao sẽ có độ tan cao hơn nên thời gian lƣu ngắn sẽ ra trƣớc. Nhận định này phù hợp với phổ MS của HPβCD có nhiều pic tƣơng ứng với các phân tử có các DS khác nhau và có 1 pic với cƣờng độ rất nhỏ tƣơng ứng với M = 1681,05 và 1 số pic nhỏ khác có phân tử lƣợng lớn hơn nhƣng cƣờng độ không đủ lớn để nhận diện trên phổ đồ (phụ lục 4, hình PL.4.8). Kết luận này là có cơ sở vì căn cứ vào đƣờng nền của phổ 1H-NMR của HPβCD tổng hợp thì mẫu này có độ tinh khiết cao hơn nhiều so với phƣơng pháp HPLC (phụ lục 4, hình PL.4.2). Một số dƣợc điển nhƣ BP, Eur. Ph, USP-NF không đƣa tỷ lệ phần trăm (%) độ tinh khiết vào tiêu chuẩn sản phẩm (hydroxypropyl betadex) mà chỉ so sánh tỷ lệ diện tích giữa các pic phụ của sản phẩm với pic tham chiếu của βCD (≤ 1,5%) và propylen glycol (≤ 2,5%) [21], [35], [99].
Các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu suất và DS của phản ứng tổng hợp HPβCD: Đƣợc chọn phù hợp với 1 số nghiên cứu đã đƣợc công bố trên tạp chí quốc tế [25], [27]
Vận tốc khuấy:
Khuấy quá yếu làm cho sự tiếp xúc giữa βCD và 1,2-propylen oxid giảm, phản ứng xảy ra chậm, tạo nhiều tạp chất. Khuấy nhanh làm cho 1,2-propylen oxid bay hơi khỏi dung dịch phản ứng, hiệu suất giảm.
HPβCD tạo thành trong quá trình phản ứng có khả năng tự liên kết tạo polyme [54], có độ nhớt rất cao trong môi trƣờng kiềm. Mặt khác, các phân tử HPβCD tự liên kết với nhau tạo thành các tập hợp [69], [114], cản trở sự tiếp xúc của βCD với 1,2-propylen oxid. Chọn vận tốc khuấy phù hợp làm tăng tiếp xúc giữa βCD và 1,2-propylen oxid để phản ứng tiếp tục xảy ra.
Nhiệt độ phản ứng:
Nhiệt độ thấp làm phản ứng xảy ra chậm tạo điều kiện cho 1,2-propylen oxid tự phản ứng tạo tạp chất.
Nhiệt độ cao làm phản ứng xảy ra nhanh đồng thời tạp chất cũng tạo ra nhiều. 1,2-propylen oxid bốc hơi khỏi dung dịch phản ứng, hiệu suất giảm.
Thời gian phản ứng:
Thời gian ngắn làm phản ứng xảy ra không hoàn toàn. Thời gian dài sẽ tạo nhiều tạp chất. So với nghiên cứu của Seung Hei Cho [87] tối ƣu hóa các yếu tố của qui trình tổng hợp đã rút ngắn thời gian phản ứng từ 24 giờ xuống còn 22 giờ. Đây là một trong những yếu tố quan trọng để giảm giá thành sản phẩm.
Hiệu suất của phản ứng:
Tối ƣu hóa các yếu tố của qui trình áp dụng vào tổng hợp cỡ lô kg cho hiệu suất 86,79%. So với nghiên cứu của tác giả Chao Yuan và cộng sự, các yếu tố của qui trình tổng hợp đƣợc chọn là thời gian phản ứng, nhiệt độ phản ứng và thời gian thẩm tách để làm thông số tối ƣu cho hiệu suất 61,80% [25]. Nhƣ vậy hiệu suất của qui trình tổng hợp đã đạt đƣợc so với tác giả Chao Yuan cao hơn gấp 1,4 lần. Đây là yếu tố góp phần làm giảm giá thành sản phẩm dùng làm tá dƣợc.
4. 1.2. Xác định cấu trúc của HPβCD tổng hợp bằng dữ liệu phổ NMR 4. 1.2.1. Phân tích phổ NMR của βCD: (trình bày ở phụ lục 2)
Để có cơ sở cho việc phân tích hệ thống dữ liệu của HPβCD tổng hợp, phổ của βCD đã
đƣợc xem xét kỹ lƣỡng. Lợi thế đặc biệt của hệ thống phổ NMR của βCD là ở phổ 13C-NMR, 6 tín hiệu của βCD là C-1, C-2, C-3, C-4, C-5, C-6đều hoàn toàn tách biệt. Từ
đó qua phổ HSQC, khẳng định đƣợc vị trí và đặc điểm của các tín hiệu 1H tƣơng ứng, đặc biệt là tín hiệu của H-6 và H-5 vì ngay ở βCD 2 tín hiệu này cũng đã chồng lấp.
Bảng 4.1. Dữ liệu phổ NMR của βCD đo trong D2O. Loại phổ 13C, DEPT (90, 135), tần số đo 125 MHz. 1H, HSQC, HMBC, tần số đo: 500 MHz, T = 302 K Vị trí Nhóm cấu trúc δ13 C ppm δ1H, J(Hz)*, Độ bội (ppm) HMBC H→C 1 101,85 5,505, d, J = 3,5 2, 3, 4, 5 2 72,09 3,631, dd J1 = 3, J2 = 9,5 1, 3, 4 3 73,09 3,943, dd, J1 = J2 = 9,5 2, 4, 5 4 81,14 3,563, dd, J1 = J2 = 9,5 2, 5, 6, 1 5 71,83 3,824, m, chèn lấp 4 6 60,32 3,800, m, chèn lấp - * Hằng số tƣơng tác (độ tách vạch), tính bằng Hz.
Từ bảng 4.1 có thể thấy một đặc điểm “khác thƣờng” là proton của -CH2- (6) không thể hiện bất kỳ một tƣơng tác xa nào với các carbon 1, 2, 3, 4, 5. Trong nghiên cứu của nhóm tác giả Ding Haiyun thậm chí còn không ghi H-6 vào phổ [32].
Hai proton 1 và 4 có tƣơng tác xa mạnh (4→1, 4→6 và 1→5).
Proton H-4 có tƣơng tác với tất cả carbon, trừ không hoặc tƣơng tác rất yếu với C-3. Đây cũng là một đặc điểm “khác thƣờng”, đặc điểm này cho thấy góc liên kết vicinal (3J) của H-3 và H-4 nằm trong vùng từ 80 - 100 ppm.
Đặc điểm cấu hình của βCD gồm 7 đơn vị glucopyranose có dạng hình ghế, (C-1 khi đóng vòng với C-5 qua cầu nối oxy chỉ cách nhau 2 liên kết đơn). Các đơn vị glucopyranose liên kết với nhau thành vòng nên các hydro nằm ở trong vòng sẽ gần với carbon hơn, trong khi các nhóm CH2 (C-6) nằm ngoài vòng làm cho khoảng cách giữa các hydro này xa hơn với các carbon trong vòng. Từ các đặc điểm này làm cho phổ NMR của βCD tạo lên các đặc điểm “khác thƣờng”.
4.1.2.2. Phân tích phổ NMR của HPβCD thƣơng mại (tiêu chuẩn Eur. Ph/USP, hãng sản xuất: Roquette-Pháp): (trình bày ở phụ lục 3, hình PL.3.2 – PL.3.7)
Bảng 4.2. Dữ liệu phổ NMR của HPβCD thƣơng mại đo trong D2O. Loại phổ 1H và 13C. Phổ 13C, DEPT (90, 135), tần số đo 125 MHz. Phổ 1H, COSY, HSQC, HMBC tần số đo 500 MHz. T = 297 K. Vị trí Nhóm cấu trúc δ13C ppm δ1H ppm J(Hz) Độ bội (ppm) COSY HH HMBC HC 1 101,81 5,00 vạch tù * 2 2,3,4 11 99,53 5,140 chồng lấp với 12** 12 100,63 5,162 chồng lấp với 11 2 72,08 3,560 vạch tù Vùng các vạch chéo tƣơng quan chập không xác định đƣợc 2',3,4,1 21,22 71,54 3,580 vạch tù 3 73,10 3,882 vạch tù 2,5,4 31,32 72,89 3,863 vạch tù 4 81,10 3,520 vạch tù 1,2,3,5, 6 41,42 79,56 3,535 vạch tù 5,51,52 71,83 3,74 chồng lấp với 6 và 1'2 3,4 6,61,62 60,32 3,794 chồng lấp với 5 và 3 5,4 1'1,2 (a*) 76,93 3,755 chồng lấp với 2 và 5 2',2,1 1'1,2 (b*) 76,22 3,455 chồng lấp với 4 2'1 66,70 3,95 chồng lấp với 2'2 3' 1' 2'2 66,40 3,90 chồng lấp với 2'1 3' 3'1 18,33 1,073 không tách vạch giữa 3'1 và 3'2 2' 2,1 3'2 18,07 2'
4.1.2.3. Phân tích phổ NMR của HPβCD tổng hợp (trình bày ở phụ lục 4, hình PL.4.2 – PL.4.7)
Bảng 4.3. Dữ liệu phổ NMR của HPβCD tổng hợp đo trong D2O. Loại phổ 1H và 13C. Phổ 13C, DEPT (90, 135), tần số đo 125 MHz. Phổ 1H, COSY, HSQC, HMBC tần số đo 500 MHz. T = 302 K. Vị trí Nhóm cấu trúc δ13C ppm δ1H ppm J(Hz) Độ bội (ppm) COSY HH HMBC HC 1 101,76 5,155 vạch tù 2,1 2,3,4 11 99,32 5,296 vạch tù 12 100,53 5,317 vạch tù 2 72,13 3,723 vạch tù Vùng các vạch chéo tƣơng quan chập không xác định đƣợc 2',3,4,1 21,22 71,58 3,723 vạch tù 3 73,15 4,033 vạch tù 2,5,4 31,32 72,96 4,014 vạch tù 4 80,96 3,665 vạch tù 1,2,3,5,6 41,42 79,89 3,682 vạch tù 5,51,52 71,88 3,935 chồng lấp với 6 3,4 6,61,62 60,41 3,957 chồng lấp với 5 và 3 5,4 1'1,2 (a*) 76,93 3,810 chồng lấp với 2 và 5 1,2' 2',2,1 1'1,2 (b*) 76,27 3,607 chồng lấp với 4 1,2' 2'1 66,78 4,100 chồng lấp với 2'2 3',1' 1' 2'2 66,34 4,087 chồng lấp với 2'1 3',1' 3'1 18,42 1,113 không tách vạch 2' 2,1 3'2 18,08 2'
Phân tích dữ liệu phổ NMR: trên cơ sở thông tin ban đầu từ βCD, việc phân tích phổ HPβCD tổng hợp cũng đƣợc xuất phát từ phổ 13C.
Nguyên tắc chung của sự thế này là C-1 ở đầu cầu của phân tử 1,2-propylen oxid sẽ tƣơng
tác với 2 nhóm OH là OH-C-2, OH-C-3 của βCD để hình thành liên kết -C(2)-O-R (R = -CH2-CHOH-CH3), -C(3)-O-R ở nồng độ kiềm thấp và nhóm OH-C-6 để hình thành
liên kết -C(6)-O-R ở nồng độ kiềm cao.
Tuy nhiên, theo Hong Yuan Sun và cộng sự [43], [49] đã nghiên cứu, sự thế OH-C-6 (là alcol bậc nhất) rất khó khăn, cần có những điều kiện đặc biệt. Vì vậy trong quá trình thế đã đƣợc thực hiện ở môi trƣờng kiềm thấp ở đây sản phẩm thu đƣợc chỉ bao gồm sự thế vào vị trí OH ở C-2 và C-3 của từng mắt xích trong 7 mắt xích glucopyranose hoàn toàn đồng nhất của βCD.
Vì quá trình thế xảy ra bất kỳ ở mắt xích nào, do đó trong quá trình thế có thể có mắt xích bị thế 1 lần, có mắt xích bị thế 2 lần, có mắt xích chƣa bị thế, trừ khi cả 7 mắt xích đều bị thế 2 lần (hiệu suất thế 100%).
Vì vậy tín hiệu cộng hƣởng từ 1
H hay 13C của HPβCD, ví dụ 13
C-1 hay 1H-1 sẽ tách thành 3 vạch: 1 vạch tƣơng ứng với mắt xích không bị thế ký hiệu là 1 (chƣa thế), 1 vạch ký hiệu là 11 (thế 1 lần), 1 vạch ký hiệu là 12 (thế 2 lần). Sự tách thành 3 vạch về nguyên lý, xảy ra cho mọi tín hiệu 1
H hay 13C. Tuy nhiên sự giãn phổ có thể gây lên sự chồng chập do vạch phổ bị mở rộng, đặc biệt là phổ 1H. Thí dụ H-5 và H-6 của βCD chƣa thế cũng đã bị chồng chập.
Về gốc thế vì không có dạng nguyên nên trong quá trình thế chỉ xuất hiện sự tách thành 2 vạch, thí dụ 1'1 và 1'2. Đó là nguyên tắc của quá trình đánh số đƣợc ghi trong bảng dữ liệu phổ.
Theo qui ƣớc đánh số trên, xuất phát từ phổ 13C, kết quả phân tích phổ đƣợc trình bày ở cột δ13C ppm.
Từ giá trị δ13C ppm, bằng phổ HSQC xác định tiếp giá trị δ1H ppm. Phổ COSY và HMBC cung cấp thêm sự khẳng định kết quả.
Điều khó khăn ở đây là vùng phổ 1H, trừ vị trí H-1 của βCD và CH3-(3') của HPβCD, phần còn lại đều bị giãn vạch và chồng chập. Sự chồng chập này càng tăng mạnh vì nhóm
-CH2- (1') chứa 2 proton không tƣơng đƣơng đƣợc chỉ ra rất rõ ở phổ HSQC. Nếu ở phổ βCD cụm tín hiệu H-2 và H-4 tách rời hẳn khỏi cụm tín hiệu của H-5 và H-6 thì ở HPβCD 2 tín hiệu H-1'(a) và H-1'(b) lại chèn vào giữa 2 cụm tín hiệu khiến cho, trừ 2 tín hiệu H-1 và H-3(3'), tất cả các tín hiệu proton còn lại đều chen phủ.
Tuy nhiên sự nhận diện xuất phát từ phổ 13C (13C & DEPT 90, DEPT 135) và phổ tƣơng quan 2D-HSQC cũng đã giúp cho việc xây dựng bảng số liệu đƣa ra trên đây là đủ độ tin cậy để từ đó làm cơ sở so sánh và khẳng định hợp chất HPβCD tổng hợp đƣợc là chính xác.
Phân tích toàn bộ hệ thống dữ liệu của HPβCD tổng hợp so với HPβCD thƣơng mại có thể thấy rõ đây là 2 mẫu hoàn toàn đồng nhất về cấu trúc, biến động về các giá trị δ1
H và δ13C đều không đáng kể, chấp nhận đƣợc vì 2 mẫu này có DS khác nhau.
Nhìn chung phổ HPβCD thƣơng mại có độ phân giải tốt hơn phổ của HPβCD tổng hợp (tuy không đáng kể). Lý do có thể do mẫu HPβCD thƣơng mại đo ở 297 K còn HPβCD tổng hợp đo ở 302 K. Nhiệt độ làm tăng độ dao động phân tử mạnh hơn vì vậy độ phân giải phổ có thể bị ảnh hƣởng. Ở đây sự chênh lệch nhiệt độ là 5 K là khoảng chênh lệch đủ nhận ra sự khác biệt.
Có một chi tiết khác biệt có thể có ý nghĩa là ở vị trí -CH2-1' khi thế vào vị trí OH-C-2 (hoặc OH-C-3) của βCD sẽ có sự phân biệt độ dịch chuyển hóa học của H-1'a và H-1'b, 2 proton của nhóm -CH2-1' không còn tƣơng đƣơng. Ở phổ HPβCD tổng hợp sự phân biệt này không rõ nhƣng ở phổ HPβCD thƣơng mại sự phân biệt này lại rõ hơn. Có thể do HPβCD thƣơng mại có DS thấp hơn, các nhóm thế gây che chắn không gian vì vậy cũng ít hơn nên độ phân giải tốt hơn. Vì vị trí này nằm ở vùng chèn lấp với H-4 và H-2 của βCD nên không thể xác định đƣợc hằng số tƣơng tác và do vậy không thể đƣa ra đƣợc một nhận xét có cơ sở khoa học.
Từ các dữ liệu phân tích phổ NMR có thể kết luận HPβCD tổng hợp đƣợc qui mô cỡ kg trong phòng thí nghiệm có cấu trúc hoàn toàn đúng và độ sạch không thua kém HPβCD thƣơng mại vì ở phổ NMR đƣờng nền phổ rất tốt, không xuất hiện vết tạp nào trừ tín hiệu dung môi D2O ở δD = 4,705 ppm.
Các chỉ số kỹ thuật liên quan rút ra từ phổ NMR: (dữ liệu phổ 1
H-NMR từ phụ lục 4 hình PL.4.2)
Mức độ thế: trong phổ 1H-NMR, 1 đơn vị cƣờng độ tín hiệu trên phổ tỷ lệ bậc nhất với nồng độ (cũng là số lƣợng) của proton tạo tín hiệu đó. Thí dụ trong cùng 1 nhóm chức -CH2-CHOH-CH3 thì cƣờng độ của tín hiệu -CH2- nếu đƣợc chọn là 2 đơn vị thì cƣờng độ của tín hiệu -CH3 phải là 3 đơn vị.
Nhƣ vậy 1 phân tử (1 mắt xích) glucopyranose nếu đã đƣợc thế ở OH-C-2 chẳng hạn, bằng 1 phân tử 2-hydroxypropyl thì tín hiệu CH3 của nhóm thế sẽ có cƣờng độ lớn gấp 3