(R- HPβCD)
2.2.3.1. Xây dựng qui trình định lƣợng rutin trong phức R-HPβCD Chuẩn bị mẫu
Mẫu chuẩn: cân chính xác khoảng 5 mg rutin chuẩn, cho vào bình định mức 50 ml, thêm
35 ml ethanol 96o, lắc đều đến khi tan hoàn toàn, thêm 0,5 ml dung dịch acid acetic 0,02 N; thêm ethanol 96o đến vạch, lắc đều (dung dịch có nồng độ khoảng 100 μg/ml).
Mẫu thử: cân chính xác một lƣợng phức R-HPβCD tƣơng ứng với khoảng 50 mg rutin,
cho vào bình định mức 10 ml, thêm 7 ml nƣớc cất nóng, lắc đều đến khi phức tan hết, để nguội, thêm nƣớc cất đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Lấy chính xác 1 ml dịch lọc trên, cho vào bình định mức 50 ml, thêm 35 ml ethanol 96o, lắc đều, thêm 0,5 ml dung dịch acid acetic 0,02 N; thêm ethanol 96o đến vạch, lắc đều (dung dịch có nồng độ qui về rutin khoảng 100 μg/ml).
Dung dịch HPβCD: cân chính xác khoảng 110,0 mg HPβCD (tƣơng ứng với lƣợng phức
R-HPβCD chứa khoảng 50 mg rutin), cho vào bình định mức 10 ml, thêm 7 ml nƣớc cất nóng, lắc đều đến khi HPβCD tan hết, để nguội, thêm nƣớc cất đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Lấy chính xác 1 ml dịch lọc trên, cho vào bình định mức 50 ml, thêm 35 ml ethanol 96o, lắc đều, thêm 0,5 ml dung dịch acid acetic 0,02 N; thêm ethanol 96o đến vạch, lắc đều.
Mẫu kiểm tra: cân chính xác khoảng 50 mg rutin chuẩn, cho vào bình định mức 10 ml,
thêm 7 ml nƣớc cất nóng, lắc đều, để nguội, thêm nƣớc cất đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Lấy chính xác 1 ml dịch lọc trên, cho vào bình định mức 50 ml, thêm 35 ml ethanol 96o, lắc đều, thêm 0,5 ml dung dịch acid acetic 0,02 N; thêm ethanol 96o đến vạch, lắc đều.
Tiến hành
Đo độ hấp thụ của mẫu chuẩn, mẫu thử, dung dịch HPβCD và mẫu kiểm tra tại bƣớc sóng 362,5 nm và 375 nm, dùng ethanol 96o chứa 1% dung dịch acid acetic 0,02 N làm mẫu trắng. Phép thử chỉ có giá trị khi mẫu chuẩn và mẫu thử có tỷ số A375/A362,5 nhỏ hơn 0,879
và độ hấp thụ của mẫu kiểm tra và dung dịch HPβCD tại bƣớc sóng 362,5 nm nằm trong khoảng ± 0,001.
Tính kết quả
Độ tinh khiết của phức R-HPβCD tính theo chế phẩm hiện trạng đƣợc tính theo công thức: ( ) Trong đó:
- X%: độ tinh khiết của phức R-HPβCD.
- At: độ hấp thụ của mẫu thử tại bƣớc sóng 362,5 nm. - Ac: độ hấp thụ của mẫu chuẩn tại bƣớc sóng 362,5 nm. - Cc: nồng độ của mẫu chuẩn (µg/ml)
- m1: phân tử lƣợng trung bình của phức R-HPβCD.
- m2: khối lƣợng trung bình của rutin có trong một phân tử lƣợng trung bình của phức R-HPβCD.
- P: lƣợng phức cân (mg).
Đánh giá qui trình
Tính chọn lọc:
Quét phổ tử ngoại (200 – 400 nm) của mẫu chuẩn, mẫu thử, dung dịch HPβCD và mẫu kiểm tra.
Yêu cầu:
- Mẫu thử phải có phổ hấp thụ tử ngoại và bƣớc sóng hấp thụ cực đại (362,5 ± 1 nm và 375 ± 1 nm) giống mẫu chuẩn.
- Mẫu chuẩn và mẫu thử có tỷ số A375/A362,5 nhỏ hơn 0,879.
- Dung dịch HPβCD và mẫu kiểm tra không có bƣớc sóng hấp thụ cực đại tại 362,5 ± 1 nm và 375 ± 1 nm. Độ hấp thụ của dung dịch HPβCD và mẫu kiểm tra tại bƣớc sóng hấp thụ cực đại 362,5 ± 1 nm phải nằm trong khoảng ± 0,001.
Khoảng tuyến tính:
Chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ khác nhau. Tiến hành đo độ hấp thụ các dung dịch chuẩn ở bƣớc sóng 362,5 nm. Mỗi dung dịch đo 3 lần, lấy giá trị trung bình. Tính hệ số tƣơng quan R và thiết lập phƣơng trình hồi quy tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ. Sử dụng trắc nghiệm F (F test, phân phối Fischer) để đánh giá tính tƣơng thích của phƣơng trình hồi quy. Sử dụng trắc nghiệm t (t test, phân phối Student) để kiểm tra ý nghĩa của các hệ số trong phƣơng trình hồi quy.
Yêu cầu: Hệ số tƣơng quan R giữa nồng độ và độ hấp thụ phải lớn hơn 0,990.
Độ chính xác:
Chuẩn bị 6 dung dịch mẫu thử và đo độ hấp thụ tại bƣớc sóng 362,5 nm. Tính độ tinh khiết của phức R-HPβCD.
Yêu cầu: độ lệch chuẩn tƣơng đối của 6 lần thử ≤ 2%.
2.2.3.2. Xác định ảnh hƣởng của HPβCD đến độ tan của rutin
Pha hòa tan: cho lƣợng dƣ rutin (1,6 g) vào dãy dung dịch HPβCD trong nƣớc có thể tích 50 ml, nồng độ tăng dần 0 mmol, 2,5 mmol, 5 mmol, 7,5 mmol, 10 mmol, khuấy hồi lƣu 400 vòng/phút trong 60 phút, để ổn định trong 24 giờ, lọc hỗn hợp qua màng lọc 0,45 μm. Pha loãng đến nồng độ thích hợp bằng ethanol 96o có chứa 1% acid acetic 0,02 N (TT), đo phổ UV ở bƣớc sóng 362,5 nm. Dựa vào đồ thị pha hòa tan đánh giá ảnh hƣởng của HPβCD đến độ tan của rutin.
2.2.3.3. Xác định tỷ lệ tạo phức giữa rutin và HPβCD
Có thể tính tỷ lệ tạo phức giữa rutin và HPβCD từ đồ thị pha hòa tan hoặc phƣơng pháp thay đổi nồng độ liên tục nếu sơ đồ pha hòa tan có dạng AL.
Phƣơng pháp thay đổi nồng độ liên tục: cân 9 mẫu rutin và HPβCD theo các tỷ lệ mol: 1 : 9; 2 : 8; 3 : 7; 4 : 6; 5 : 5; 6 : 4; 7 : 3; 8 : 2; 9 : 1. Mỗi mẫu đƣợc cho vào 1 cốc có mỏ,
tạo phức bằng phƣơng pháp đồng bay hơi với ethanol 96o. Sản phẩm đƣợc cô thu hồi dung môi, sau đó sấy ở 70 oC dƣới áp suất giảm đến khối lƣợng không đổi. Cân chính xác khoảng 0,30 g phức R-HPβCD, cho vào bình định mức 100 ml, thêm 70 ml nƣớc cất nóng, siêu âm để hòa tan phức, để nguội, thêm nƣớc cất đến vạch, lọc qua màng lọc 0,45 μm. Lấy chính xác 1 ml dịch lọc cho vào bình định mức 50 ml, thêm 0,5 ml dung dịch
acid acetic 0,02 N (TT), thêm ethanol 96o đến vạch, lắc đều. Đo phổ UV ở 362,5 nm. Tỷ lệ tạo phức của rutin đƣợc tính từ mẫu có độ tan cao nhất.
2.2.3.4. Điều chế phức R-HPβCD
Phƣơng pháp nghiền ƣớt: trộn đều rutin và HPβCD trong cối sứ trong 30 phút, thêm ethanol 70o vào hỗn hợp và nghiền trộn trong 60 phút để tạo thành khối nhão. Sấy hỗn hợp ở 70 o
C dƣới áp suất giảm đến khối lƣợng không đổi.
Phƣơng pháp đồng bay hơi dung môi: cân rutin, HPβCD, hòa rutin trong ethanol 96o , gia nhiệt (60 oC) đến khi tan hoàn toàn rồi thêm từng lƣợng nhỏ dung dịch này vào dung dịch HPβCD trong ethanol 96o. Khuấy hồi lƣu 400 vòng/phút ở nhiệt độ 60 oC đến khi đƣợc dung dịch đồng nhất, hạ đến nhiệt độ phòng, khuấy thêm 6 giờ. Dung dịch đƣợc cô thu hồi ethanol ở nhiệt độ 70 oC dƣới áp suất giảm, cắn sấy ở 70 oC dƣới áp suất giảm đến độ ẩm qui định.
2.2.3.5. Đánh giá phức R-HPβCD
Thử độ hòa tan: phức điều chế bằng các phƣơng pháp khác nhau đƣợc thử bằng máy thử độ hòa tan kiểu cánh khuấy. Môi trƣờng: 900 ml nƣớc cất, nhiệt độ: 37 ± 0,5 oC, tốc độ khuấy: 50 vòng/phút
Cân 50 mg rutin hay lƣợng bột phức R-HPβCD tƣơng ứng với 50 mg rutin, rắc đều lên bề mặt môi trƣờng. Rút 10 ml mẫu ở các thời điểm 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60 phút, bổ sung bằng 10 ml nƣớc cất sau mỗi lần rút mẫu. Lọc mẫu qua qua màng lọc 0,45 µm, sau đó pha loãng mẫu bằng ethanol 96o có chứa 1% dung dịch acid acetic 0,02 N (TT) đến nồng độ thích hợp, đo phổ UV ở 362,5 nm, xác định nồng độ rutin ở từng thời điểm.
Công thức tính độ hòa tan của rutin ở từng thời điểm:
( ) ∑
( )
Dj: độ hòa tan của rutin (%) tại thời điểm lấy mẫu phút thứ j. Cj: nồng độ của rutin (μg/ml) ở thời điểm j.
Ci: nồng độ của rutin (μg/ml) ở thời điểm i. a: lƣợng rutin cho vào (mg)
Thử độ tan: cho 200 mg rutin (dƣ) hay lƣợng phức R-HPβCD tƣơng ứng với 200 mg rutin vào bình nón nút mài chứa 100 ml nƣớc cất. Lắc trên máy lắc rung 100 vòng/phút trong 36 giờ, lọc qua màng lọc 0,45 μm. Pha loãng bằng ethanol 96o có chứa 1% dung dịch acid acetic 0,02 N (TT) đến nồng độ thích hợp. Đo phổ UV ở 362,5 nm, xác định độ tan của rutin nguyên liệu và rutin trong phức.
Phức có độ hòa tan, độ tan cao nhất tiếp tục đƣợc thử nghiệm bằng phổ IR, DSC, 1
H-NMR để xác định cấu trúc của phức R-HPβCD.
Phổ hồng ngoại (IR): chuẩn bị mẫu: nghiền khoảng 1,6 mg rutin chuẩn, HPβCD, phức R-HPβCD với khoảng 160 mg KBr (dùng cho IR), tiến hành nhƣ mục 2.2.1.2 (phổ IR). Phân tích và đánh giá sự thay đổi các đỉnh đặc trƣng của rutin chuẩn so với rutin trong phức R-HPβCD.
Phổ DSC: nhiệt đồ của rutin, HPβCD, phức R-HPβCD đƣợc ghi nhận bởi máy Mettler Toledo STARe SW. Thiết bị đƣợc hiệu chỉnh bởi indium trƣớc khi phân tích mẫu dƣới dòng khí nitơ.
Cân chính xác khoảng 5 mg rutin, HPβCD, phức R-HPβCD cho vào đĩa nhôm hàn kín, quét với tốc độ 5 oC/phút trong khoảng nhiệt độ 0 - 300 oC. Phân tích nhiệt đồ dựa vào sự xuất hiện của đỉnh nội nhiệt tƣơng ứng với nhiệt độ nóng chảy của từng chất.
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1
H-NMR): đo phổ 1
H-NMR của rutin, phức R-HPβCD trong dung môi DMSO, tần số đo 500 MHz, T = 300 K. Phân tích phổ để xác định cấu trúc của phức R-HPβCD.
2.2.3.6. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở phức R-HPβCD: gồm các chỉ tiêu về tính chất, định tính, giảm khối lƣợng do làm khô, kim loại nặng, cắn sau khi nung, độ tinh khiết, giới hạn nhiễm khuẩn.
2.2.3.7. Xây dựng qui trình điều chế phức R-HPβCD