CYCLODEXTRIN (ME-HPβCD)
2.2.9.1. Xây dựng qui trình định lƣợng meloxicam trong phức ME-HPβCD Chuẩn bị mẫu
Mẫu chuẩn: cân chính xác khoảng 5 mg meloxicam chuẩn, cho vào bình định mức 50 ml,
thêm 35 ml dung dịch đệm phosphat pH 6,5 lắc đều đến khi tan hoàn toàn, thêm dung dịch đệm phosphat pH 6,5 đến vạch, lắc đều (dung dịch có nồng độ khoảng 100 μg/ml).
Mẫu thử: cân chính xác một lƣợng phức ME-HPβCD tƣơng ứng với khoảng 50 mg ME,
cho vào bình định mức 10 ml, thêm 7 ml nƣớc cất, lắc đều đến khi phức tan hết, thêm nƣớc cất đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 μm. Lấy chính xác 1 ml dịch lọc trên, cho vào bình định mức 50 ml, thêm dung dịch đệm phosphat pH 6,5 đến vạch, lắc đều (dung dịch có nồng độ qui về meloxicam khoảng 100 μg/ml).
Dung dịch HPβCD: cân chính xác khoảng 210,3 mg HPβCD (tƣơng ứng với lƣợng phức
ME-HPβCD chứa khoảng 50 mg meloxicam), cho vào bình định mức 10 ml, thêm 7 ml
nƣớc cất, lắc đều đến khi tan hết, thêm nƣớc cất đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 μm. Lấy chính xác 1 ml dịch lọc trên, cho vào bình định mức 50 ml, thêm dung dịch
Mẫu kiểm tra: cân chính xác khoảng 50 mg meloxicam chuẩn, cho vào bình định mức 10
ml, thêm 7 ml nƣớc cất, lắc đều, thêm nƣớc cất đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 μm. Lấy chính xác 1 ml dịch lọc trên, cho vào bình định mức 50 ml, thêm dung dịch
đệm phosphat pH 6,5 đến vạch, lắc đều.
Tiến hành: đo độ hấp thụ của mẫu chuẩn, mẫu thử, dung dịch HPβCD và mẫu kiểm tra tại bƣớc sóng 363 nm, dùng dung dịch đệm phosphat pH 6,5 làm mẫu trắng. Phép thử chỉ có giá trị khi độ hấp thụ của mẫu kiểm tra và dung dịch HPβCD tại bƣớc sóng 363 nm phải nằm trong khoảng ± 0,001.
Đánh giá qui trình: tính chọn lọc, khoảng tuyến tính, độ chính xác: tiến hành tƣơng tự nhƣ mục 2.2.3.1
2.2.9.2. Xác định ảnh hƣởng của HPβCD đến độ tan của ME
Pha hòa tan: cho một lƣợng dƣ ME (0,4 g) vào 20 ml các dung dịch HPβCD trong nƣớc có nồng độ tăng dần từ 0 - 48 mmol, lắc trên máy lắc rung 100 vòng/phút trong 24 giờ, lọc hỗn hợp trên qua màng lọc 0,45 μm, pha loãng dịch lọc bằng dung dịch đệm phosphat pH 6,5 đến nồng độ thích hợp, đo phổ UV ở bƣớc sóng 363 nm. Dữ liệu pha hòa tan đƣợc thể hiện bằng đồ thị để đánh giá sự ảnh hƣởng của HPβCD đến độ tan của ME.
2.2.9.3. Xác định tỷ lệ tạo phức giữa ME và HPβCD.
Tỷ lệ tạo phức giữa ME và HPβCD đƣợc ngoại suy từ đồ thị pha hòa tan.
2.2.9.4. Điều chế phức ME-HPβCD
Phƣơng pháp nghiền ƣớt: cân ME và HPβCD theo tỷ lệ mol đã đƣợc xác định cho vào cối sứ, trộn đều trong 15 phút, thêm dung môi ethanol 96o : nƣớc (1 : 1) vào nghiền trộn hỗn hợp trong 60 phút tạo thành bột nhão. Sấy hỗn hợp ở 70 oC đến khối lƣợng không đổi.
Phƣơng pháp đồng bay hơi dung môi: cho ME vào trong bình cầu, cho ethanol 96o vào, gia nhiệt đến 60 oC, khuấy đều, nhỏ từng giọt nƣớc amoniac 25% vào tới khi ME tan hoàn toàn, hạ đến nhiệt độ phòng, cho từ từ vào dung dịch HPβCD trong ethanol 96o, khuấy hồi lƣu 400 vòng/phút trong 6 giờ, cô thu hồi ethanol ở nhiệt độ 70 oC dƣới áp suất giảm. Cắn sấy ở 70 o
2.2.9.5. Đánh giá phức ME-HPβCD Thử độ hòa tan
Độ hòa tan của ME và phức ME-HPβCD điều chế bằng các phƣơng pháp khác nhau đƣợc thử với máy thử độ hòa tan kiểu cánh khuấy. Môi trƣờng: 900 ml dung dịch đệm phosphat pH 6,5, tốc độ khuấy 50 vòng/phút, nhiệt độ 37 ± 0,5 o
C. Tiến hành tƣơng tự nhƣ mục 2.2.3.5.
Thử độ tan: Cho một lƣợng dƣ ME (0,4 g) hoặc phức ME-HPβCD chứa lƣợng ME tƣơng ứng vào các bình nón nút mài chứa 20 ml nƣớc cất. Lắc trên máy lắc rung 100 vòng/phút trong 24 giờ, lọc qua màng lọc 0,45 μm, pha loãng dịch lọc đến nồng độ thích hợp bằng dung dịch đệm phosphat pH 6,5. Đo độ hấp thụ UV ở bƣớc sóng 363 nm. Xác định độ tan trong nƣớc của ME và ME trong phức ME-HPβCD.
Phức có độ hòa tan và độ tan cao nhất đƣợc tiếp tục thử nghiệm bằng đo phổ IR, DSC: Tiến hành tƣơng tự nhƣ mục 2.2.3.5.
Phổ 1H-NMR đo trong DMSO, tần số đo 500 MHz, T = 300 K, phân tích phổ để xác định cấu trúc phức ME-HPβCD.
2.2.9.6. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở phức ME-HPβCD: gồm các chỉ tiêu về tính chất, định tính, giảm khối lƣợng do làm khô, kim loại nặng, cắn sau khi nung, độ tinh khiết, giới hạn nhiễm khuẩn.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. TỔNG HỢP 2-HYDROXYPROPYL-β-CYCLODEXTRIN (HPβCD)
3.1.1. Qui trình tổng hợp 2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrin
Cơ chế phản ứng tổng hợp HPβCD đƣợc thể hiện trong sơ đồ 3.1.
Sơ đồ 3.1. Cơ chế phản ứng tổng hợp 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin. (*) phản ứng có thể xảy ra ở cả vị trí OH-C-2 và OH-C-3.
(a) (b)
Hình 3.1. Sắc ký đồ của HPβCD tổng hợp so với βCD (a) và so với HPβCD thƣơng mại (b): vết βCD (1) HPβCD tổng hợp (2) và HPβCD thƣơng mại (3)
Sắc ký đồ của βCD là 1 vết tròn với Rf = 0,27, HPβCD tổng hợp có Rf = 0,72 và không còn vết của βCD. Sắc ký đồ của HPβCD tổng hợp so với HPβCD thƣơng mại có hình dạng tƣơng tự nhau với Rf tƣơng đƣơng.
Thăm dò ảnh hƣởng của nồng độ NaOH đến hiệu suất và DS của phản ứng:
Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của nồng độ NaOH đến hiệu suất và DS của phản ứng tổng hợp HPβCD (n = 3)
Nồng độ NaOH 1% 1,5% 1,75% 2%
Hiệu suất (%) 0* 77,12 ± 0,02 70,34 ± 0,04 61,60 ± 0,01 DS - 5,46 ± 0,012 5,04 ± 0,008 4,57 ± 0,007 *βCD sau 1 giờ không tan hết, dung dịch còn đục nên không tiến hành phản ứng.
Từ kết quả bảng 3.1, lấy nồng độ NaOH 1,5% để làm môi trƣờng cho các phản ứng tiếp theo.
3.1.2. Xác định cấu trúc của HPβCD tổng hợp
Phổ IR: cực đại hấp thụ của HPβCD tổng hợp có số sóng đặc trƣng của các nhóm chức: OH, C-H, C-O.
Bảng 3.2. So sánh phổ IR của HPβCD tổng hợp và HPβCD thƣơng mại
Nhóm chức Đỉnh hấp thụ (cm -1) HPβCD tổng hợp HPβCD thƣơng mại O-H 3384,8 3384,8 C-H 2929,7 2927,7 C-O 1031,8 1031,8
Phổ IR của HPβCD tổng hợp và HPβCD thƣơng mại (phụ lục 3, hình PL. 3.1 và phụ lục 4, hình PL. 4.1) có các đỉnh cực đại hấp thụ tƣơng tự nhau.
Phổ NMR: (D2O, δppm) (phụ lục 4 hình PL.4.2 – 4.7)
Bảng 3.3. So sánh độ dịch chuyển hóa học phổ 1H và 13C-NMR của HPβCD tổng hợp và HPβCD thƣơng mại (phụ lục 3 hình PL.3.2 – PL.3.3 và phụ lục 4 hình PL.4.2 – 4.3) Vị trí HPβCD tổng hợp HPβCD thƣơng mại 13 C-NMR 1H-NMR 13C-NMR 1H-NMR 1 101,76 5,16 101,81 5,00 2 72,13 3,72 72,08 3,56 3 73,15 4,03 73,10 3,88 4 80,96 3,67 81,10 3,52 5 71,88 3,94 71,83 3,74 6 60,41 3,96 60,32 3,79 1′1,2 (a) 76,93 3,81 76,93 3,76 1′1,2 (b) 76,27 3,61 76,22 3,46 2′1 66,78 4,10 66,70 3,40 2′2 66,34 4,09 66,40 3,90 3′1 18,42 1,11 không tách vạch 18,33 1,07 không tách vạch 3′2 18,08 18,07
Từ kết quả so sánh ở bảng 3.3 cho thấy 2 mẫu có sự khác biệt nhỏ về độ dịch chuyển hóa học của δ1H và δ13
C, sự khác biệt này là do 2 sản phẩm có DS khác nhau. Từ kết quả so sánh độ dịch chuyển hóa học của phổ 1H và 13C-NMR có thể kết luận sản phẩm HPβCD đã đƣợc tổng hợp có cấu trúc đúng nhƣ dự kiến.
Phổ khối (MS): HPβCD tổng hợp có các đồng phân có khối lƣợng phân tử tƣơng ứng với 9 DS khác nhau phân bố liên tục từ 1 đến 9,(phụ lục 4, hình PL.4.8)
3.1.3. Xác định các yếu tố của phản ứng ảnh hƣởng đến hiệu suất và DS của sản phẩm tổng hợp
Vận tốc khuấy:
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của vận tốc khuấy đến hiệu suất và DS của phản ứng tổng hợp HPβCD
Vận tốc (vòng/phút) 400 600 800 1000 1200 Hiệu suất (%) 78,13 79,36 79,49 79,30 78,46
DS 5,37 5,60 5,67 5,65 5,67
Biểu đồ 3.1. Ảnh hƣởng của vận tốc khuấy đến hiệu suất và DS của phản ứng tổng hợp HPβCD.
Dựa vào kết quả phân tích trong bảng 3.4 và biểu đồ 3.1 có thể thấy khi thay đổi vận tốc khuấy sẽ dẫn đến hiệu suất và DS bị thay đổi, hiệu suất đạt giá trị cao khi vận tốc khuấy trong khoảng 600 - 1000 vòng/phút, khi vận tốc khuấy tăng trên 1000 vòng/phút thì DS tăng nhƣng hiệu suất giảm. Vì vậy, trong nghiên cứu quy trình tổng hợp khoảng vận tốc khuấy đƣợc khảo sát là 600 - 1000 vòng/phút.
Nhiệt độ của phản ứng
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hiệu suất và DS của phản ứng tổng hợp HPβCD
Nhiệt độ (oC) 20 25 30 35 40 45
Hiệu suất (%) 77,74 78,65 78,59 78,59 78,33 77,55
Biểu đồ 3.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hiệu suất và DS của phản ứng tổng hợp HPβCD.
Dựa vào kết quả phân tích trong bảng 3.5 và biểu đồ 3.2 có thể thấy khi thay đổi nhiệt độ sẽ làm thay đổi hiệu suất và DS, hiệu suất và DS đạt giá trị cao khi nhiệt độ trong khoảng 20 - 40 oC. Vì vậy, trong nghiên cứu quy trình tổng hợp khoảng nhiệt độ đƣợc khảo sát là 20 - 40 oC.
Thời gian phản ứng
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của thời gian đến hiệu suất và DS của phản ứng tổng hợp HPβCD
Thời gian (giờ) 14 16 18 20 24 28
Hiệu suất (%) 74,76 75,54 78,33 79,49 79,75 78,78
DS 4,88 5,51 5,64 5,67 5,60 5,91
Biểu đồ 3.3. Ảnh hƣởng của thời gian đến hiệu suất và DS của phản ứng tổng hợp HPβCD
Dựa vào kết quả phân tích trong bảng 3.6 và biểu đồ 3.3 có thể thấy khi thay đổi thời gian phản ứng sẽ làm thay đổi hiệu suất và DS, hiệu suất đạt giá trị cao khi thời gian trong khoảng 16 - 24 giờ, khi thời gian phản ứng tăng quá 24 giờ thì DS tăng nhƣng hiệu suất
giảm. Vì vậy, trong nghiên cứu quy trình tổng hợp khoảng thời gian đƣợc khảo sát là 16 - 24 giờ.
3.1.4. Tối ƣu hóa các yếu tố của qui trình tổng hợp ảnh hƣởng đến hiệu suất và DS của sản phẩm
Mã hóa các yếu tố biến thiên khảo sát
Bảng 3.7. Mã hóa các yếu tố biến thiên khảo sát qui trình tổng hợp HPβCD Yếu tố biến thiên
khảo sát Mã hóa Mức dƣới (-1) Mức giữa (0) Mức trên (+1) Vận tốc khuấy (v) x1 600 800 1000 Nhiệt độ (to ) x2 20 30 40 Thời gian (t) x3 16 20 24
Bố trí thí nghiệm
Bảng 3.8. Bố trí thí nghiệm Box-Behnken mức cơ bản kiểu bề mặt đáp ứng và kết quả hiệu suất và DS của qui trình tổng hợp HPβCD
STT Bố trí thí nghiệm Vận tốc (x1) Nhiệt độ (x2) Thời gian (x3) Hiệu suất (%) (y1) DS (y2) 1 +0- 1000 30 16 75,600 5,542 2 +0+ 1000 30 24 78,261 5,841 3 ++0 1000 40 20 76,574 5,363 4 000 800 30 20 80,078 5,754 5 0+- 800 40 16 79,040 5,939 6 -+0 600 40 20 80,921 5,527 7 000 800 30 20 79,689 5,502 8 0++ 800 40 24 78,585 5,508 9 0-+ 800 20 24 79,559 5,803 10 0-- 800 20 16 78,975 5,152 11 -0+ 600 30 24 76,639 5,603 12 --0 600 20 20 76,184 5,880 13 +-0 1000 20 20 79,753 5,388 14 000 800 30 20 79,494 5,806 15 -0- 600 30 16 79,169 5,202
Kết quả từ phần mềm JMP 4.0 với mô hình Box-Behnken: (phụ lục 4, hình PL.4.9 và bảng PL.4.1 – bảng PL.4.4)
Tƣơng quan giữa các yếu tố khảo sát đến hiệu suất với R2
= 0,97 và đến DS với R2 = 0,83.
Ảnh hƣởng của các yếu tố khảo sát đến y1 (hiệu suất): x1 với tƣơng quan nghịch, x2 và x3 với tƣơng quan thuận.
Ảnh hƣởng của các yếu tố khảo sát đến y1 theo thứ tự giảm dần:
Phƣơng trình bề mặt đáp ứng theo y1:
Ảnh hƣởng của các yếu tố khảo sát đến y2 (DS): x1 với tƣơng quan nghịch, x2 và x3 với tƣơng quan thuận.
Ảnh hƣởng của các yếu tố khảo sát đến y2 theo thứ tự giảm dần:
Phƣơng trình bề mặt đáp ứng theo y2:
Kết quả tối ƣu cho từ phần mềm JMP 4.0:
Vận tốc khuấy 851,00 vòng/phút, nhiệt độ 28,5 oC, thời gian 22,00 giờ Hiệu suất 79,63%, DS 5,65
Tiến hành 3 phản ứng tổng hợp thực nghiệm ở điều kiện tối ƣu:
Bảng 3.9. Hiệu suất và DS của 3 phản ứng tổng hợp HPβCD ở điều kiện tối ƣu Phản ứng Hiệu suất (%) DS PU1 79,82 5,65 PU2 80,27 5,63 PU3 79,29 5,67 Trung bình 79,79 5,65 Dự báo 79,63 5,65
So sánh giữa kết quả bề mặt đáp ứng dự báo và phản ứng thực nghiệm ở điều kiện tối ƣu, kết quả khác nhau không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Phần mềm dự báo điều kiện và kết quả phản ứng đúng với thực nghiệm.
3.1.5. Tổng hợp HPβCD có các DS khác nhau
Tiến hành phản ứng tổng hợp ở điều kiện tối ƣu với sự thay đổi tỷ lệ mol βCD : 1,2- propylen oxid:
Các yếu tố cố định: βCD 5 mmol, H2O 100 ml, NaOH 0,0375 mol, 1,2-propylen oxid thay đổi từ 30 - 55 mmol với = 5 mmol.
Bảng 3.10. Sản phẩm của phản ứng tổng hợp HPβCD với tỷ lệ mol βCD : 1,2-propylen oxid khác nhau
1,2-propylen oxid (mmol) 30 35 40 45 50 55
Phản ứng PL1 PL2 PL3 PL4 PL5 PL6
Hiệu suất (%) 69,37 76,83 79,82 80,01 81,38 85,14
DS 4,35 5,13 5,58 6,09 6,27 6,83
(PL: ký hiệu của phản ứng giữa βCD và 1,2-propylen oxid với các tỷ lệ mol khác nhau)
Biểu đồ 3.4. Sự phụ thuộc của hiệu suất và DS vào tỷ lệ mol 1,2-propylen oxid tham gia phản ứng tổng hợp HPβCD.
Hiệu suất và DS của HPβCD tổng hợp tăng theo sự gia tăng tỷ lệ 1,2-propylen oxid tham gia phản ứng.
3.1.6. Nâng sản phẩm của phản ứng tổng hợp HPβCD lên cỡ lô kg
Thiết kế bình phản ứng: bình gồm 2 phần: phần dƣới là hình nón cụt úp ngƣợc với đáy nhỏ ở dƣới đảm bảo dung dịch phản ứng khuấy lên trên luôn có xu hƣớng trở về đáy. Phần trên là một nửa mặt cầu đƣợc hàn kín với phần dƣới. Phía ngoài trên mặt cầu đƣợc hàn một phễu để chứa nƣớc đá làm lạnh. Cánh khuấy kiểu cánh quạt đặt lệch tâm gần sát dƣới đáy để khi khuấy hồi lƣu kéo phần không khí phía trên bề mặt xuống, hạn chế đến mức thấp nhất 1,2-propylen oxid bay hơi khỏi dung dịch phản ứng. Phía trên bình phản ứng gồm 1 ống để cho 1,2-propylen oxid vào phản ứng, 1 ống gắn sinh hàn làm lạnh. Ở giữa có nắp đậy gắn trục khuấy và gắn vào bình phản ứng với vòng đệm đƣợc xiết chặt. Toàn bộ thiết bị đƣợc chế bằng inox không gỉ. (phụ lục 1, hình PL.1.1a).
Công thức cỡ lô kg: βCD 1135 g, 1,2-propylen oxid 565,5 ml, NaOH 150 g, H2O 10.000 ml
Bảng 3.11. Hiệu suất và DS của phản ứng tổng hợp HPβCD cỡ lô kg Phản ứng Sản phẩm (kg) Hiệu suất (%) DS
PK1 1,30 87,68 5,97
PK2 1,28 86,55 5,85
PK3 1,27 86,15 5,91
Trung bình 1,28 86,79 5,91
So sánh giữa kết quả bề mặt đáp ứng dự báo và phản ứng thực nghiệm cỡ lô kg ở điều kiện tối ƣu, kết quả khác nhau không có ý nghĩa, (P > 0,05). Phần mềm dự báo điều kiện tối ƣu hoàn toàn có thể ứng dụng vào phản ứng tổng hợp cỡ lô kg.
3.1.7. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của HPβCD tổng hợp: phụ lục 15
Kết quả kiểm nghiệm HPβCD tổng hợp:
Độ tinh khiết: (phụ lục 4, hình PL.4.10)
( )
∑
Bảng 3.12. Kết quả kiểm nghiệm của HPβCD tổng hợp (phụ lục 29)
Chỉ tiêu Mức chất lƣợng Kết quả
Tính chất Bột trắng hoặc gần nhƣ trắng, dễ tan trong nƣớc và methanol.
Đạt Ðịnh tính Chế phẩm phải có phổ IR, NMR,
MS đặc trƣng của HPβCD.
Đúng Ðộ trong và màu sắc Dung dịch chế phẩm phải trong và
không màu.
Đạt
Nhiệt độ nóng chảy 255 - 265 oC Đạt
pH Từ 6 đến 7 Đạt
Góc quay cực riêng Từ + 120 đến + 140 Đạt
Giảm khối lƣợng do làm khô Không quá 5% Đạt
Kim loại nặng Không quá 20 ppm. Đạt