2.2.1. TỔNG HỢP 2-HYDROXYPROPYL-β-CYCLODEXTRIN (HPβCD)2.2.1.1. Qui trình tổng hợp 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin 2.2.1.1. Qui trình tổng hợp 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin
Sơ đồ qui trình tổng hợp 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin (xem sơ đồ 2.1 trang 34)
Các bƣớc tiến hành nhƣ sau:
Bước 1. Điều chế2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin:
Mức khởi đầu: hòa tan 1,5 g NaOH (0,0375 mol) trong 100 ml nƣớc cất trong bình cầu 250 ml, thêm 5,79 g βCD (5 mmol, 98%), dung dịch đƣợc khuấy hồi lƣu trong 1,5 giờ. 2,83 ml 1,2-propylen oxid (2,35 g 99%, 40 mmol) đƣợc thêm vào từng lƣợng nhỏ trong 1 giờ. Sau đó dung dịch đƣợc khuấy hồi lƣu ở nhiệt độ phòng cho đến khi phản ứng kết thúc. Theo dõi bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (TLC):
Điều kiện sắc ký: bản mỏng silicagel GF254
Hệ dung môi khai triển: isopropanol - ethylacetat - nƣớc (5 : 2 : 2) (tt : tt : tt)
Bản mỏng thứ nhất: chấm vết thứ nhất 10 µl dung dịch βCD 0,5% trong nƣớc, vết thứ 2 10 µl dung dịch phản ứng.
Bản mỏng thứ 2: chấm 1 vết thứ nhất 10 µl dung dịch phản ứng, vết thứ 2 10 µl dung dịch HPβCD đối chiếu nồng độ 0,5% trong nƣớc.
Phát hiện: dùng hơi iod bão hòa.
Chỉ tiêu đánh giá: trên sắc ký đồ của bản mỏng thứ nhất không còn phát hiện vết βCD trong dung dịch phản ứng, bản mỏng thứ 2: vết sản phẩm tạo thành không còn kéo đuôi và có Rf tƣơng đƣơng với HPβCD đối chiếu.
Bước 2. Tinh chế sản phẩm: sau khi kết thúc phản ứng, dung dịch acid HCl 1 M đƣợc
thêm vào để trung hòa hỗn hợp phản ứng và điều chỉnh đến pH trung tính. Cô loại nƣớc ở 80 oC dƣới áp suất giảm đến khi dịch sánh nhƣ siro, cho ethanol 99,5% với lƣợng vừa đủ để hòa tan sản phẩm, khuấy khoảng 30 phút, muối NaCl không tan trong ethanol sẽ kết
tủa, lọc loại muối. Thêm aceton vào dịch lọc khuấy trong 30 phút ở nhiệt độ 0 - 5 oC đến khi sản phẩm tủa hoàn toàn. Lọc lấy tủa, hòa trong lƣợng tối thiểu ethanol 99,5% và thêm aceton lặp lại nhiều lần đến khi tủa tạo bột tơi. Sấy khô ở 80 oC dƣới áp suất giảm đến độ ẩm qui định.
Bước 3. Đóng gói và dán nhãn: đóng gói trong túi polyethylen hàn kín, dán nhãn bảo
quản ở nhiệt độ phòng.
Sơ đồ 2.1. Qui trình tổng hợp 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin
NaCl
Cô dung dịch phản ứng
(Dƣới áp suất giảm, nhiệt độ 80 o
C)
Điều chế dung dịch βCD/NaOH
(Khuấy hồi lƣu: vận tốc, nhiệt độ, thời gian)
Aceton 1,2-propylen oxid HCl 1 M Ethanol 99,5% Đóng gói thành phẩm Thu sản phẩm
(Sấy khô dƣới áp suất giảm, nhiệt độ 80o
C)
Kiểm nghiệm
Beta cyclodextrin
Thu lấy sản phẩm thô (tủa)
(Khuấy 30 phút, nhiệt độ 0 - 5 oC, lọc) Aceton
Lọc lấy dung dịch chứa HPβCD (Khuấy 30 phút)
NaOH + H2O
Phản ứng tổng hợp HPβCD
Khuấy hồi lƣu: vận tốc (x1), nhiệt độ (x2), thời gian (x3)
Thăm dò ảnh hƣởng của nồng độ NaOH đến hiệu suất và DS của phản ứng: xác định ở 4 mức nồng độ NaOH: 1%, 1,5%, 1,75% và 2%. Các thành phần khác tham gia phản ứng giữ nguyên nhƣ mức khởi đầu. Ở mỗi nồng độ NaOH tiến hành 3 phản ứng. Từ kết quả thu đƣợc, xác định nồng độ NaOH phù hợp cho phản ứng tổng hợp.
Hiệu suất của phản ứng (x%): đƣợc tính bằng cách cân trực tiếp sản phẩm sau khi đã tinh chế và kiểm tra độ tinh khiết, sấy đến độ ẩm qui định (< 5%) theo công thức:
( )
( ) ( )
m: khối lƣợng (g) của sản phẩm tổng hợp đã tinh chế. n: số mol βCD tham gia phản ứng
MβCD: phân tử gam của βCD
DS: độ thế của sản phẩm HPβCD tổng hợp tính từ phổ 1
H-NMR đo trong D2O M1,2-propylen oxid: phân tử gam của 1,2-propylen oxid.
2.2.1.2. Xác định cấu trúc của HPβCD tổng hợp
Lấy sản phẩm của phản ứng ở mức khởi đầu sau khi đã tinh chế đạt độ tinh khiết để đo phổ IR, 1H và 13C-NMR, phổ MS:
Phổ IR: áp dụng kỹ thuật viên KBr.
Chuẩn bị mẫu thử: nghiền 1 - 2 mg chất thử với 100 - 200 mg bột mịn KBr (dùng cho IR) đã đƣợc sấy khô, đủ để tạo thành 1 viên nén có đƣờng kính 13 mm và cho phổ có cƣờng độ phù hợp. Hỗn hợp đƣợc nghiền cẩn thận và rải đều trên 1 khuôn thích hợp. Nén khuôn có hỗn hợp chất thử tới áp suất khoảng 800 Mpa trong điều kiện chân không.
Tiến hành đo phổ: phổ IR của mẫu thử phải có các đỉnh hấp thụ đặc trƣng của các nhóm chức: O-H, C-H, C-O và phù hợp với phổ IR của mẫu HPCD đối chiếu.
Phổ NMR: đo phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC trong dung môi D2O trên máy NMR Bruker AC 500 MHz: xác định tƣơng tác H→H, H→C và cấu trúc của sản phẩm tổng hợp.
Phổ khối (MS): đo trong methanol ở khoảng từ 0 - 2000 m/z trên máy đo phổ khối bằng kỹ thuật ESI (electrospray ionization): xác định sự phân bố các phân tử HPβCD có các DS khác nhau trong sản phẩm tổng hợp.
2.2.1.3. Xác định các yếu tố của phản ứng ảnh hƣởng đến hiệu suất và DS của sản phẩm tổng hợp
Các yếu tố của phản ứng tổng hợp ảnh hƣởng đến hiệu suất và DS của sản phẩm đƣợc chọn khảo sát gồm: vận tốc khuấy, nhiệt độ, thời gian của phản ứng.
- Vận tốc khuấy (x1) chọn khoảng thăm dò từ 400 - 1200 vòng/phút với Δv = ± 200 vòng/phút.
- Nhiệt độ của phản ứng (x2) chọn khoảng thăm dò từ 20 - 45 oC với Δto = ± 5 oC - Thời gian phản ứng (x3) chọn khoảng thăm dò từ 14 - 28 giờ với Δt = ± 2 giờ.
2.2.1.4. Tối ƣu hóa các yếu tố của qui trình tổng hợp ảnh hƣởng đến hiệu suất và DS của sản phẩm
Ứng dụng phần mềm JMP 4.0 với mô hình Box-Behnken để thiết kế thực nghiệm theo kiểu bề mặt đáp ứng (responce surface design DOE)
Các yếu tố cố định: 5 mmol βCD, 40 mmol 1,2-propylen oxid, 100 ml H2O, 0,0375 mol NaOH.
Các yếu tố biến thiên khảo sát: từ các phản ứng thăm dò tìm ra khoảng biến thiên và mã hóa các yếu tố: vận tốc khuấy (x1), nhiệt độ (x2), thời gian (x3).
Tiến hành 15 phản ứng trong đó có 3 phản ứng lặp lại ở tâm gồm các yếu tố độc lập: x1, x2, x3. Hai yếu tố phụ thuộc đƣa vào khảo sát là hiệu suất (y1) và DS (y2) của phản ứng. Chỉ tiêu đánh giá: y1 và y2 cao nhất và có độ lặp lại.
Hình 2.1. Bố trí thí nghiệm kiểu thiết kế bề mặt đáp ứng (DOE)
DS tính từ kết quả đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1H-NMR) của HPβCD trong D2O Tính các thông số tối ƣu dựa vào phƣơng trình:
Hoặc sử dụng phần mềm Box-Behnken.
Xác định hệ số tƣơng quan và ảnh hƣởng của các yếu tố đến hiệu suất và DS của sản phẩm tổng hợp từ kết quả của phần mềm Box-Behnken.
Từ kết quả phần mềm dự báo, tiến hành 3 phản ứng tổng hợp ở điều kiện tối ƣu để kiểm tra lại.
2.2.1.5. Tổng hợp HPβCD có các DS khác nhau
Tiến hành phản ứng ở điều kiện tối ƣu với sự thay đổi tỷ lệ mol βCD : 1,2-propylen oxid. Các yếu tố cố định: 5 mmol βCD, 100 ml H2O, 0,0375 mol NaOH.
Yếu tố thay đổi: 1,2-propylen oxid tăng từ 30 - 60 mmol với Δ = 5 mmol đến khi sản phẩm có DS tƣơng đƣơng 7 để tìm ra hiệu suất và DS phù hợp cho từng sản phẩm.
Chỉ tiêu của sản phẩm: chọn tỷ lệ mol βCD : 1,2-propylen oxid lúc đầu, sản phẩm của phản ứng có DS tƣơng đƣơng với DS của HPβCD thƣơng mại (DS = 4,4). Ở sản phẩm cuối có DS gần 7 là sản phẩm khi tổng hợp vẫn còn dùng phƣơng pháp tinh chế bằng aceton và sản phẩm ổn định khi bảo quản ở nhiệt độ phòng.
2.2.1.6. Nâng sản phẩm của phản ứng tổng hợp HPβCD lên cỡ lô kg
Từ kết quả tối ƣu và phản ứng kiểm chứng, thiết kế bình phản ứng và dụng cụ cô loại nƣớc phù hợp, tiến hành nâng lô tổng hợp lên cỡ kg.
2.2.1.7. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và kiểm nghiệm HPβCD tổng hợp Tính chất: bột trắng hoặc trắng ngà, dễ tan trong nƣớc và methanol.
Định tính: Phổ IR, NMR, MS: (tiến hành nhƣ mục 2.2.1.2), yêu cầu: phổ IR, NMR, MS của sản phẩm tổng hợp có các tín hiệu đặc trƣng phù hợp với phổ của HPβCD đối chiếu.
Độ trong và màu sắc: hòa tan 1,0 g chế phẩm trong 2,0 ml nƣớc cất và đun nóng. Dung dịch sau khi để nguội đến nhiệt độ phòng phải trong và không màu (thử theo DĐVN IV, phụ lục 9.3)
Nhiệt độ nóng chảy: tiến hành theo DĐVN IV, phụ lục 6.7, phƣơng pháp 1. Yêu cầu: chế phẩm phải có nhiệt độ nóng chảy nằm trong khoảng từ 255 đến 265 o
C
pH: cân 0,5 g chế phẩm hòa tan trong 50 ml nƣớc, đo pH. Dung dịch phải có pH từ 6 - 7.
Góc quay cực riêng: xác định góc quay cực của dung dịch 1% trong nƣớc ở nhiệt độ 20 oC: tiến hành theo DĐVN IV, phụ lục 6.4.
Giảm khối lƣợng do làm khô: xác định trên 1,0 g chế phẩm. Dùng chén cân có nắp mài làm bì đựng mẫu, sấy ở nhiệt độ 120 oC trong 2 giờ, lấy ra để nguội trong bình hút ẩm, cân xác định khối lƣợng bì (a g). Cân mẫu thử (m g) cho vào chén cân đã cân bì, đem sấy ở nhiệt độ 120 oC trong 2 giờ, để nguội trong bình hút ẩm, cân xác định khối lƣợng cả bì và mẫu đã sấy khô (b g).
Hàm lƣợng nƣớc bị mất x(%) sau khi sấy đƣợc tính theo công thức:
( ) ( ) ( )
Kim loại nặng: hòa tan 5,0 g chế phẩm trong 50 ml nƣớc không có carbon dioxid (dung dịch S): tiến hành theo DĐVN IV, phụ lục 9.4.8, phƣơng pháp 1.
Cắn sau khi nung: xác định trên 1,0 g chế phẩm: tiến hành theo DĐVN IV, phụ lục 9.8, phƣơng pháp 2.
Độ tinh khiết: áp dụng phƣơng pháp HPLC và qui về 100% diện tích đỉnh để xác định độ tinh khiết của sản phẩm.
Chuẩn bị mẫu thử: cân chính xác khoảng 2,0 g chế phẩm cho vào bình định mức 100 ml, hòa tan trong khoảng 75 ml nƣớc, thêm nƣớc vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 m. Tiến hành sắc ký 6 lần theo điều kiện sau:
Máy sắc ký lỏng Shimadzu LC-20AD. Cột pha đảo C18 (150 x 4,6 mm) cỡ hạt 5 m. Pha động: nƣớc. Tốc độ dòng 0,5 ml/phút. Đầu dò RI. Nhiệt độ cột: 40 o
C. Thể tích 1 lần tiêm mẫu: 20 l.
Phép thử chỉ có giá trị khi RSD của thời gian lƣu và diện tích đỉnh của đỉnh chính không quá 2%, hệ số bất đối của đỉnh chính nằm trong khoảng 0,8 - 1,5 và độ phân giải của đỉnh chính và đỉnh phụ (nếu có) phải lớn hơn 1,5.
Tính kết quả: độ tinh khiết của sản phẩm đƣợc tính theo công thức:
( )
∑ ( )
: diện tích của đỉnh chính, ∑ : tổng diện tích của các đỉnh phụ
Độ thế (DS): dựa vào phổ 1H-NMR đo trong D2O
Mức độ thay thế phân tử (ms): là số nhóm 2-hydroxypropyl trên mỗi phân tử glucopyranose đƣợc tính theo công thức:
( )
A1: cƣờng độ của tín hiệu ở khoảng 0,9 - 1,2 ppm ứng với tín hiệu của 3 proton của nhóm methyl trong nhóm thế 2-hydroxypropyl.
A2: cƣờng độ tín hiệu ở khoảng 5,0 - 5,4 ppm ứng với độ dịch chuyển hóa học của proton glycosidic
DS của sản phẩm đƣợc tính theo công thức: DS = 7 x ms (Một phân tử HPβCD có 7 đơn vị glucopyranose)
Độc tính bất thƣờng: thử theo phƣơng pháp chung của DĐVN IV, phụ lục 13.5.
2.2.1.8. Theo dõi độ ổn định của HPβCD tổng hợp
HPβCD tổng hợp đƣợc bảo quản ở nhiệt độ phòng (30 oC ± 2 oC, độ ẩm 75% ± 5%), kiểm tra các chỉ tiêu: tính chất, độ trong và màu sắc, pH, độ tinh khiết sau các thời điểm: 0, 3, 6, 9, 12, 24 tháng. Tiến hành trên 3 lô cỡ kg.
2.2.1.9. Xây dựng qui trình tổng hợp HPβCD
Từ kết quả phản ứng tổng hợp cỡ lô kg, xây dựng qui trình tổng hợp 2-hydroxypropyl-β- cyclodextrin.
2.2.2. TỔNG HỢP 2-HYDROXYBUTYL-β-CYCLODEXTRIN (HBβCD)2.2.2.1. Qui trình tổng hợp 2-hydroxybutyl-β-cyclodextrin 2.2.2.1. Qui trình tổng hợp 2-hydroxybutyl-β-cyclodextrin
Mức khởi đầu: tiến hành tƣơng tự nhƣ mục 2.2.1.1 nhƣng thay 1,2-propylen oxid bằng 1,2-butylen oxid 3,51 ml (2,91 g 99%, 40 mmol), theo dõi bằng TLC, pha động isopropanol - nƣớc amoniac 25% - nƣớc: 3 : 1 : 1 (tt : tt : tt).
Tinh chế sản phẩm: tiến hành tƣơng tự nhƣ mục 2.2.1.1
Thăm dò ảnh hƣởng của nồng độ NaOH đến hiệu suất và DS của phản ứng: xác định ở 3 mức nồng độ: 1,5%, 2% và 3%. Các thành phần khác tham gia phản ứng giữ nguyên nhƣ mức khởi đầu, Ở mỗi nồng độ NaOH tiến hành 3 phản ứng. Từ kết quả thu đƣợc, xác định nồng độ NaOH phù hợp cho phản ứng tổng hợp.
Hiệu suất của phản ứng (x%): đƣợc tính theo công thức (1) mục 2.2.1.1 nhƣng thay M 1,2-propylen oxid bằng M 1,2-butylen oxid
2.2.2.2. Xác định cấu trúc của HBβCD tổng hợp
Lấy sản phẩm của phản ứng ở mức khởi đầu sau khi đã tinh chế đạt độ tinh khiết để đo phổ IR, NMR, MS: tiến hành tƣơng tự nhƣ mục 2.2.1.2.
2.2.2.3. Xác định các yếu tố của phản ứng ảnh hƣởng đến hiệu suất và DS của sản phẩm tổng hợp
Các yếu tố khảo sát là: vận tốc khuấy, nhiệt độ, thời gian.
- Vận tốc khuấy (x1) chọn khoảng thăm dò từ 400 - 1200 vòng/phút với Δv = ± 200 vòng/phút.
- Nhiệt độ của phản ứng (x2) chọn khoảng thăm dò từ 20 - 45 oC với Δto = ± 5 oC - Thời gian phản ứng (x3) chọn khoảng thăm dò từ 14 - 28 giờ với Δt = ± 2 giờ.
2.2.2.4. Tối ƣu hóa các yếu tố của qui trình tổng hợp ảnh hƣởng đến hiệu suất và DS của sản phẩm: ứng dụng phần mềm JMP 4.0 với mô hình Box-Behnken để thiết kế thực nghiệm theo kiểu bề mặt đáp ứng (responce surface design DOE): tiến hành tƣơng tự nhƣ mục 2.2.1.4.
2.2.2.5.Tổng hợp HBβCD có các DS khác nhau
Tiến hành phản ứng ở điều kiện tối ƣu với sự thay đổi tỷ lệ mol βCD : 1,2-butylen oxid. Các yếu tố cố định: 5 mmol βCD, 100 ml H2O, 0,0375 mol NaOH.
Yếu tố thay đổi: 1,2-butylen oxid tăng từ 30 - 60 mmol với Δ = 5 mmol đến khi sản phẩm có DS tƣơng đƣơng 7 để tìm ra hiệu suất và DS phù hợp cho từng sản phẩm.
Chỉ tiêu của sản phẩm: chọn tỷ lệ mol βCD : 1,2-butylen oxid lúc đầu, sản phẩm của phản ứng có DS tƣơng đƣơng 4,4. Ở sản phẩm cuối có DS gần 7 là sản phẩm khi tổng hợp vẫn còn dùng phƣơng pháp tinh chế bằng aceton và sản phẩm ổn định khi bảo quản ở nhiệt độ phòng.
2.2.2.6. Nâng sản phẩm của phản ứng tổng hợp HBβCD lên cỡ lô kg
Từ kết quả tối ƣu và phản ứng kiểm chứng, thiết kế dụng cụ phản ứng và dụng cụ cô loại nƣớc phù hợp, tiến hành nâng lô tổng hợp lên cỡ kg.
2.2.2.7. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và kiểm nghiệm HBβCD tổng hợp: tiến hành tƣơng tự nhƣ mục 2.2.1.7.
2.2.2.8. Theo dõi độ ổn định của HBβCD tổng hợp:
HBβCD tổng hợp đƣợc bảo quản ở nhiệt độ phòng (nhiệt độ 30 o
C ± 2 oC, độ ẩm 75% ± 5%), kiểm tra các chỉ tiêu: tính chất, độ trong và màu sắc, pH, độ tinh khiết sau các thời điểm: 0, 3, 6, 9, 12, 24 tháng. Tiến hành trên 3 lô cỡ kg.
2.2.2.9. Xây dựng qui trình tổng hợp HBβCD
Từ kết quả phản ứng tổng hợp cỡ lô kg, xây dựng qui trình tổng hợp 2-hydroxybutyl-β- cyclodextrin.