Nhóm Tiêm MSU Loại dịch chiết Liều lƣợng (mg/kg thể trọng)
DC sinh học Không Khơng -
Đối chứng Có Khơng -
Colchicine Có Colchicine 0,2
Tía tơ- Nƣớc- 1 Có Tía tơ 50
Tía tơ- Nƣớc- 2 Có Tía tơ 25
Tía tơ- Nƣớc- 3 Có Tía tơ 10
Gắm- Nƣớc- 1 Có Dây gắm 50
Gắm- Nƣớc- 2 Có Dây gắm 25
Gắm- Nƣớc- 3 Có Dây gắm 10
Tía tơ- EtOH- 1 Có Tía tơ 50
Tía tơ- EtOH- 3 Có Tía tơ 10
Gắm- EtOH- 1 Có Dây gắm 50
Gắm- EtOH- 2 Có Dây gắm 10
Trạng thái stress oxi hóa của chuột đƣợc tiến hành trên mẫu mơ gan chuột sau khi đã mổ giải phẫu và đƣợc xác định thông qua định lƣợng Malonedialhyde (MDA), một sản phẩm thứ cấp của q trình peroxide hóa lipid. Nghiên cứu này sử dụng quy trình định lƣợng MDA bằng phƣơng pháp TBARS, đƣợc phát triển bởi Mitsuru Uchiyama và Midori Mihara (1978) đã cải tiến để phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm ở Việt Nam, cụ thể các quy trình nhƣ sau [29]:
2.2.7.1. Đánh giá tính trạng stress oxi hóa ở mẫu gan
Mẫu gan đƣợc thu lấy sau khi mổ. Mẫu đƣợc rửa sạch bằng dung dịch muối sinh lý và bảo quản ở nhiệt độ -200C trƣớc khi tiến hành thí nghiệm. Trong trƣờng hợp cần phải vận chuyển và bảo quản lâu dài, mẫu đƣợc ngâm trong dung dịch đệm bảo quản bao gồm 125mM NaCl, 3mM KCl, 1mM MgCl2, 40mM Tris và giữ ở nhiệt độ -80oC. Khi tiến hành thí nghiệm, mẫu đƣợc chia nhỏ thành các
phần có khối lƣợng 50mg. Mẫu đƣợc chia trong trạng thái đông cứng và hạn chế tối đa sự chênh lệch nhiệt độ trong tồn bộ q trình chia mẫu. Mẫu gan đƣợc đem cân, chia nhỏ và bổ sung đệm bảo quản theo tỷ lệ 1:10 (w/v). Sau khi bổ sung đệm, mẫu đƣợc nghiền đồng thể bằng máy nghiền trong 2 phút.
Dung dịch phản ứng bao gồm 2,0ml HCl (pH 3,0), 1,0ml TBA 0,06%, 0,5ml SDS 5% và 0,5ml dịch nghiền đồng thể. Sau khi bổ sung đầy đủ các thành phần, hỗn hợp đƣợc đem ủ ở 98oC trong 45 phút. Dịch phản ứng sau khi ủ sẽ đƣợc để nguội ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, sau đó bổ sung n-Butanol với tỷ lệ 1:1 (v/v). Hỗn hợp dịch phản ứng và n-Butanol đƣợc đem đi lắc mạnh trƣớc khi ly tâm 3000 xg, trong 15 phút ở nhiệt độ phòng nhằm loại bỏ các thành phần khác. Sau khi ly tâm, thu dịch nổi. Dịch chiết sau khi ly tâm đƣợc đem đi định lƣợng bằng phƣơng pháp quang phổ hấp thụ ở bƣớc sóng 535nm và xác định nồng độ thông qua công thức: Sau khi đo, lƣợng MDA trong mẫu đƣợc tính tốn dựa trên cơng thức:
Trong đó:
mMDA: là lƣợng MDA có trong mẫu A535: độ hấp thu ở bƣớc sóng 535 nm ε= 1.65x105
L: quang trình (= 1cm) V: thể tích mẫu đo (2 mL) M= 72,07 g/mol
2.2.7.2. Đánh giá tính trạng stress oxi hóa ở màng hồng cầu
- Tách chiết màng hồng cầu từ máu
Máu tổng số của đƣợc lấy về và lƣu trữ ở 40C. Mẫu máu đƣợc ly tâm 1000 xg để tách huyết tƣơng và lƣu trữ ở -200C, lấy 300-400 µl máu vào ống falcol. Tiếp đó, bổ sung đệm PBS (Phosphate buffer Saline) theo tỷ lệ 1:10 (v/v), đảo nhẹ ống. Tiếp tục ly tâm mẫu 600 xg, ở 40C, sau đó hút bỏ dịch nổi.
Tế bào hồng cầu thu đƣợc, bổ sung đệm Phosphate theo tỷ lệ 1:10 (v/v), voltex mạnh, ủ ở -200C, sau đó li tâm hỗn hợp ở 20000 xg, 40
C, trong 10 phút, hút bỏ dịch nổi. Thao tác trên đƣợc lặp lại 3 lần. Cuối cùng, khi đã loại bỏ đƣợc hoàn toàn hemogloin trong hỗn hơp, tiến hành thu màng hồng cầu vào một ống epp 1,5ml và lƣu trữ ở 40o
C.
- Xác định hàm lượng protein tổng số bằng phương pháp Bradford
Cơ sở phƣơng pháp: Cho protein phản ứng với thuốc thử Coomassie Briiliant Blue sẽ hình thành hợp chất màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bƣớc sóng 595 nm. Từ giá trị độ hấp thụ quang tại bƣớc sóng 595 nm (A595) sẽ xác định đƣợc lƣợng protein có trong dung dịch.
- Xác định hàm lượng MDA bằng phương pháp TBARS
Chuẩn bị dung dịch TBA 0,75% trong HCl 0,3N và dung dịch TCA 1%, pha trộn hai dung dịch trên theo tỷ lệ 1:1 (v/v). Tính tốn thể tích dung dịch màng cần lấy cho 1 phản ứng bằng công thức:
Trong đó:
V0,25: Thể tích màng hồng cầu cho 1 phản ứng (chứa 0,25mg/ml protein tổng số trên màng hồng cầu.)
C: Nồng độ (mg/ml) protein tổng số. Thành phần một phản ứng bao gồm:
Pha trộn hỗn hợp phản ứng nhƣ trên trong một ống eppendorf 1,5 ml. Mỗi mẫu, pha 3 phản ứng với thành phần nhƣ nhau. Hỗn hợp đƣợc đem đi voltex, ủ ở 980C, trong 30 phút. Cứ sau 10 phút, đảo ống vài lần. Sau khi ủ, ly tâm ở 1000 xg, trong 10 phút và thu dịch nổi. Dịch thu đƣợc đo tại bƣớc sóng 535 nm bằng máy đo quang phổ, lấy giá trị OD trung bình của 3 lần đo. Dựa vào hàm số:
Trong đó:
A : giá trị OD thu đƣợc ε : Hệ số hấp thụ điện tử
l : Chiều dài ánh sáng truyền qua C : Nồng độ mol của chất hấp thụ.
Từ cơng thức tính hàm lƣợng MDA tham gia phản ứng:
Từ đây ta có khối lƣợng MDA trên 1mg Protein tổng số đƣợc tính bằng:
2.2.8. Phân tích số liệu
Số liệu đƣợc xử lý trên phần mềm Excel 2009, Minitab Ver.18, SPSS Statistics 23 và đƣợc biểu diễn dƣới dạng Giá trị trung bình ± SE.
Chƣơng 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tối ƣu hóa quy trình chiết
3.1.1. Tối ưu hóa lượng dung mơi
Sau khi đƣợc chiết xuất, toàn bộ dịch chiết của các dƣợc liệu đều đƣợc đi đo phổ hấp thụ với bƣớc sóng từ 200-800 nm. Từ các đồ thị phổ hấp thụ (hình 12 và hình 13), đa số các thành phần đều hấp thụ tại một vùng nhất định, điều này cho thấy, các chất đƣợc chiết xuất có thể thuộc cùng một nhóm hợp chất. Đặc biệt, tất cả các dịch chiết đều có đỉnh hấp thụ ở vùng từ 250-350 nm, đây là vùng hấp thụ cực đại của đa số các hợp chất thuộc lớp phenolic [38]. Ở các dịch chiết từ lá, có thêm các đỉnh hấp thụ ở vùng từ 400- 450 nm và một đỉnh nhỏ trong vùng từ 650-700 nm, đây là các vùng hấp thụ đặc trƣng của các sắc tố có trong lá dƣợc liệu. Từ hình 12, các đỉnh hấp thụ có xu hƣớng giảm dần theo số lần chiết và đến lần chiết rút thứ 4, các đỉnh đã khơng xuất hiện nữa, chỉ có một đỉnh hấp thụ nhỏ ở vùng dƣới 250 nm. Nhƣ vậy, lƣợng dung mơi cần sử dụng để có thể chiết tồn bộ dƣợc chất có trong 1 g mẫu là 30 ml dung môi.
a
c
d
Hình 12: Phổ hấp thụ dịch chiết tía tơ sau các lần chiết 1 (a), 2 (b), 3 (c) và 4 (d).
3.1.2. Tối ưu hóa thời gian chiết
Từ kết quả của thí nghiệm trên, các mẫu dƣợc liệu đều đƣợc chiết với tỷ lệ 1:30 (w/v) nhằm chiết đƣợc toàn bộ hoạt chất có trong dƣợc liệu. Các mẫu đƣợc chiết trong các khoảng thời gian 4 giờ, 8 giờ, 16 giờ và 24 giờ ở 600C. Từ hình 13, dịch chiết trong 4 giờ thấp hơn các dịch chiết đƣợc chiết từ 8 giờ đến 24 giờ tại vùng từ 250-350 nm, trong khi đó, cƣờng độ hấp thụ ở 3 thời điểm sau khơng có sự khác biệt nhiều.
Từ kết quả này có thể kết luận, nghiên cứu đã xây dựng thành cơng quy trình tách chiết các hợp chất từ các dƣợc liệu ban đầu và có thê sử dụng cho các thí nghiệm sau.
a
b
c
d
Hình 13: Phổ hấp thụ của dịch chiết thổ phục linh sau 4 giờ (a), 8 giờ (b), 16 giờ (c), 24 giờ (d)
3.2. Xác định các thành phần có trong dịch chiết bằng TLC
Bên cạnh việc xác định phổ hấp thụ trong dải bƣớc sóng từ 200-800 nm, tồn bộ các dịch chiết cũng đồng thời đƣợc chạy sắc ký bản mỏng với pha động gồm Chloroform: Methanol: Ethyl acetate: Nƣớc (16,2:18,8:52:3 (v/v)). Kết quả TLC cho thấy hầu hết trên sắc ký đồ các dịch chiết chỉ có một hoặc một vài bằng xuất hiện và tất cả các băng đều có khả năng phát huỳnh quang, nhƣ vậy, trong dịch chiết có thể chứa chứa các hợp chất thuộc lớp phenolic cần quan tâm, tuy nhiên, các hợp chất phenolic này có thể khơng cùng nhóm phân loại, dẫn đến việc hình thành nên nhiều băng phát huỳnh quang ở trên đƣờng chạy. Trong khi đó, một số các dịch chiết nhƣ dịch chiết của Tía tơ và Lá lốt, ngồi các hợp chất thuộc lớp phenolic ra, còn có các băng sắc tố đặc trƣng cho dịch chiết lá thực vật. Bên cạnh đó, sắc ký đồ của một số dịch chiết nhƣ của các dịch chiết của Thiên niên kiện không xuất hiện bất kỳ băng nào, cho thấy, trong dịch chiết khơng có các chất thuộc lớp phenolic quan tâm (Hình 14).
Hình 14: Sắc ký bản mỏng một số dịch chiết thu đƣợc
Bản 1: Dịch chiết Dâu tằm Bản 2: Dịch chiết Lá lốt Bản 3: Dịch chiết Tía tơ Bản 4: Dịch chiết Dây Gắm Bản 5: Dịch chiết Thiên niên kiện
3.3. Kết quả HPLC và thu các phân đoạn
Từ kết quả sắc ký bản mỏng, các dịch chiết đƣợc đem đi chạy sắc ký HPLC nhằm phân tích thành phần phenolic acids có trong mẫu dịch chiết. Đầu dị đƣợc sử dụng ở đây là đầu dò Diode Array Detector (DAD) và đọc kết quả ở các bƣớc sóng 254 nm, 275 nm, 305 nm và đầu dị huỳnh quang tồn dải từ 350-800nm. Một số dịch chiết cho kết quả phân tách bằng HPLC rất tốt, ví dụ nhƣ dịch chiết với ethanol của dây gắm. Nhƣ ở hình dƣới, có thể thấy sắc ký đồ có các đỉnh hấp thụ nhọn, hẹp, có tính đối xứng và tách biệt với nhau. Kết hợp phân tích với sắc ký đồ phát huỳnh quang dải từ 350-800 nm, có thể thấy các đỉnh hấp thụ tại 275 nm và 305 nm cũng trùng với các vùng huỳnh quang xuất hiện trên sắc ký đồ. Ví dụ nhƣ trong hình 15, đỉnh xuất hiện từ phút thứ 18 đến 20 của đồ thị hấp thụ bƣớc sóng 275 nm và 305 nm cũng là vùng phát huỳnh quang dải từ 350-460 nm. Các phân đoạn này đƣợc thu lấy để thực hiện các nghiên cứu sau này, các phân thu đƣợc liệt kê trong bảng 6.
Từ kết quả phân tích phổ hấp thụ từ 200-700 nm, cũng nhƣ sắc ký đồ TLC và HPLC, có thể kết luận, nghiên cứu đã tách thành công các thành phần thuộc nhóm polyphenols và phenolic acids từ các loại dƣợc liệu đƣợc chọn. Tuy nhiên, cần nghiên cứu và phát triển kỹ thuật tách chiết các hợp chất thuộc lớp phenolic có trong thiên niên kiện.
Hình 15: Đồ thị HPLC của dịch chiết dây gắm với Ethanol
a. Phổ huỳnh quang dịch chiết dây gắm với Ethanol
b. Phổ hấp thụ 305 nm của dịch chiết dây gắm với Ethanol c. Phổ hấp thụ 275 nm của dịch chiết dây gắm với Ethanol