Thời gian (phút) Đệm B 0-5 25% 5-10 25-30% 10-16 30-45% 16-18 45% 18-25 45-80% 25-30 80% 30-40 80-25%
Sau khi xác định đƣợc vị trí các đỉnh, chúng tơi tiến hành thu lấy các phân đoạn cho các thí nghiệm tiếp theo ( nhƣ MS, NMR,…) nhằm định danh đƣợc một cách chính xác loại hợp chất có trong dịch chiết [39].
2.2.4. Định lượng khả năng chống oxi hóa tổng số bằng phương pháp quét gốc tự do DPPH
Trong phƣơng pháp thử khả năng chống oxi hóa bằng DPPH, các chất có hoạt tính kháng oxi hóa trung hịa gốc DPPH bằng cách cho một nguyên tử hydro, từ đó làm giảm cƣờng độ hấp thụ tại bƣớc sóng 517 nm của dung dịch, màu của dung dịch chuyển từ tím (màu đặc trƣng của DPPH) sang vàng [22].
Đầu tiên, 4,3 mg DPPH đƣợc pha trong 3,3 ml Ethanol 1000
. Hỗn hợp phản ứng gồm 3,5 ml Ethanol 1000, 250 µl DPPH và 250 µl mẫu. Hỗn hợp đƣợc cho chung vào ống epp, lắc mạnh và ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Sau khi ủ, hỗn hợp đƣợc đem đo giá trị hấp thụ ở bƣớc sóng 517 nm. Mẫu chuẩn đƣợc sử dụng ở đây là vitamin C đƣợc pha thành nhiều nồng độ từ 0.01 mM đến 10 mM. Từ giá trị hấp thụ kết hợp với đƣờng chuẩn vitamin C có thể đánh giá khả năng chống oxi hóa của mẫu tƣơng đƣơng với bao nhiêu mM vitamin C. Ngồi ra, có thể dựa vào cơng thức sau để xác định khả năng chống oxi hóa:
Trong đó:
AA%: là phần trăm chống oxi hóa Acontrol: Giá trị hấp thụ của DPPH Amẫu: Giá trị hấp thụ của mẫu
Mẫu dịch chiết đƣợc pha loãng ở nhiều nồng độ khác nhau xác định giá trị AA% của các mốc nồng độ này, từ đó xây dựng đƣờng chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa sự thay đổi nồng độ và giá trị AA% bằng phần mềm Minitab Ver.18. Từ đƣờng chuẩn thu đƣợc, giá trị IC50 đƣợc xác định, từ đó đánh giá khả năng chống oxi hóa của dịch chiết.
2.2.5. Ni cấy và thử độc tính trên dịng tế bào RAW 264.7
- Giã đông tế bào
Tế bào ban đầu đƣợc lƣu trong nitơ lỏng. Trƣớc khi đƣa đi nuôi cấy, tế bào đƣợc giã đông với tốc độ tăng nhiệt là 10
C/phút và cuối cùng ổn định nhiệt độ ở 370C trong bể ổn nhiệt 15-20 phút. Môi trƣờng nuôi cấy đƣợc chuẩn bị sẵn gồm môi trƣờng DMEM high glucose có bổ sung 10% FBS, 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin và làm ấm từ từ trong 15-20 phút ở 370C. Đổ 15 ml mơi trƣờng ni cấy mới vào bình ni cấy 75 cm2, lƣu ý, cần giữ ấm môi trƣờng ni cấy trong tồn bộ q trình. Sau đó, nhúng ống tế bào vào cồn 700 trƣớc khi cấy vào bình ni để tiệt trùng bên ngồi vỏ ống. Giữ ống tế bào trong tay 2-3 phút rồi mở nắp, hút tế bào ra và chuyển vào trong bình ni cấy. Duy trì tế bào ở 370
C, khơng khí ẩm với 5% CO2. Sau khoảng 24 giờ, các tế bào đã có thể bám dính đƣợc trên thành bình, lúc này cần hút bớt môi trƣờng cũ ra và bổ sung 15 ml mơi trƣờng mới vào bình. Khi các tế bào đã phủ 80% bề mặt bình ni cấy, chuyển chúng sang bình ni cấy mới.
- Cấy chuyển tế bào
Trong q trình cấy chuyển, mơi trƣờng ni cấy tế bào RAW 264.7 vẫn đƣợc giữ ấm nhƣ trong quy trình giã đơng để tránh làm shock nhiệt cho tế bào. Chuẩn
bị sẵn ống cấy chuyển đã có chứa mơi trƣờng DMEM high glucose có bổ sung 10% FBS, 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin và đƣợc làm ấm. Thay môi trƣờng nuôi cấy cũ và rửa tế bào với 10ml PBS. Sau khi hút rửa, nhẹ nhàng cào nhẹ lớp tế bào đang bám trên thành bình cho đến khi chúng bong ra, lúc này bổ sung môi trƣờng mới vào trong bình ni cấy, đồng thời hút nhả dịch nuôi cấy liên tục và tránh tạo bọt. Hút 10 µl dịch nuôi cấy tế bào mới vào hemacytometer. Từ số tế bào có trên một milimet vng ni cấy, có thể tính đƣợc tổng số tế bào có trong bình ni. Chuyển tế bào vào trong các ống chuyển hoặc bình ni mới. Duy trì tình trạng phủ của tế bào trên bề mặt bình ln nhỏ hơn 80%.
- Thử độc tính dịch chiết với MTT
Tế bào RAW 264.7 đƣợc nuôi cấy trên đĩa 96 giếng với nồng độ 1x104 tế bào/ml (tƣơng đƣơng 100 µl/giếng) và đƣợc xử lý với các dịch chiết ở các mức nồng độ khác nhau trong 24 giờ ở 370C, 5% CO2.
Độc tính của các dịch chiết với tế bào RAW 264.7 đƣợc thử bằng thí nghiệm MTT. MTT gốc đƣợc pha với nồng độ 5 mg/ml bằng PBS và đƣợc khử trùng bằng màng lọc với kích thƣớc lỗ 0,22 µm và đƣợc bảo quản ở 40C. Bổ sung 100 µl MTT vào mỗi giếng và ủ ở 370C, 5% CO2 trong 4 giờ. Sau khi ủ, loại bỏ dịch nổi và bổ sung 100 µl 0,04N HCl (pha trong 2-propanol) vào tất cả các giếng. Lắc đều các giếng trong 20-45 giây để formazan ở đáy giếng có thể hịa tan vào dung môi, tạo thành dung dịch đồng thể. Ủ đĩa 96 giếng ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Sau khi ủ, đọc giá trị hấp thụ của đĩa ở bƣớc sóng 570 nm. [11]
- Định lượng IL-1β bằng phương pháp ELISA
Tế bào đƣợc ni cấy trong mơi trƣờng có bổ sung LPS với nồng độ 1 µg/ml và trong 6 giờ và sau đó đƣợc kích thích với MSU nồng độ 500 ng/ml trong 6 giờ tiếp theo. Sau khi ni cấy, lƣợng IL-1β có trong dịch ni cấy tế bào đƣợc định lƣợng bằng phƣơng pháp ELISA với bộ kit Mouse IL-1 beta Uncoated ELISA (Invitrogen, Australia). Sau đó, kết quả ELISA đƣợc đo và ghi lại bằng máy đo quang phổ Spectra Max Plus 384.
Kết quả thu đƣợc xem đƣợc đem đi phân tích để xác định giá trị LD50 của cao dịch chiết.
2.2.6. Gây viêm trên mơ hình chuột Swiss và thử nghiệm thuốc trên chuột
- Gây viêm trên mơ hình chuột
Chuẩn bị dung dịch MSU chuẩn theo tỷ lệ 1:10 (w/v) trong dung dịch PBS. Chuột đực Swiss trắng đƣợc nuôi ổn định điều kiện và thúc đẩy cân nặng từ 17 g lên đến 30±2 g. Trƣớc khi tiêm MSU, chuột đƣợc đo các chỉ tiêu sinh lý nhƣ trọng lƣợng, kích thƣớc khớp 2 chi sau và cố định các chi. Sử dụng kim tiêm 30 ½ G để hút dung dịch MSU và tiêm vào vùng khớp chi sau trái của chuột với lƣợng 50µl/chi. Sau khi tiêm 24h, tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu sinh lý của chuột một lần nữa trƣớc khi mổ giải phẫu các cơ quan.
- Thử nghiệm thuốc trên chuột
Từ kết quả các thí nghiệm định tính và định lƣợng, các dịch chiết đƣợc chọn ra. Trƣớc khi cho chuột uống, tất cả các dịch chiết đều đƣợc đem đi cô đặc ở 600
C trong 12 giờ. Sau khi tất cả dung môi đã bay hơi hết, bổ sung nƣớc vào trong falcon với lƣợng phù hợp. Sau đó, tất cả các mẫu đƣợc bảo quản ở nhiệt độ 40C. Trƣớc khi tiến hành tiêm MSU 24 giờ, chuột thí nghiệm đƣợc cho uống thuốc với các liều lƣợng 50 mg/kg thể trọng, 25 mg /kg thể trọng và 10 mg/kg thể trọng, liều lƣợng này tƣơng đƣơng với việc chuột hấp thụ 50 mg, 25 mg và 10 mg dƣợc liệu khô trên một kg thể trọng.
2.2.7. Đánh giá tình trạng stress oxi hóa trên chuột thí nghiệm
Từ kết quả trên, nhóm nghiên cứu đã tiến hành thử nghiệm một số cao chiết lên chuột, đối chứng sinh học là nhóm chuột đƣợc tiêm PBS, khơng đƣợc uống bất kỳ loại thuốc nào. Nhóm đối chứng âm là nhóm đƣợc gây sƣng bằng MSU (150 mg/ml) nhƣng không đƣợc uống bất kỳ loại thuốc nào. Nhóm chuột đối chứng dƣơng đƣợc uống colchicine với liều lƣợng 0,2 µg/g thể trọng.