Nhóm chuột
Trƣớc khi
uống thuốc Trƣớc khi tiêm Sau khi tiêm Tỷ lệ sƣng (%)
Đối chứng sinh học 7,54 7,43 7,59 8,13 7,84 8,12 3,29 Đối chứng 6,25 5,56 5,83 6,87 13,07 8,31 124,10 Colchicine 5,08 6,34 6,18 8,1 12,27 7,65 98,54 Tía tơ- Nƣớc- 1 5,86 7,54 7,41 7,27 16,47 7,12 122,27 Tía tơ- Nƣớc- 2 701 7,15 7,83 8,69 14,73 7,04 88,12 Tía tơ- Nƣớc- 3 6,72 7,27 7,95 8,7 16,37 7,44 105,91 Gắm- Nƣớc- 1 5,91 7,15 8,4 8,80 12,96 9,29 51,29 Gắm- Nƣớc- 2 6 7,14 9,32 8 12,78 6,75 37,29 Gắm- Nƣớc- 3 7,63 9,3 7,96 8,1 17,67 7,52 122,12
Tía tơ- EtOH- 1 5,82 7,02 6,5 6,47 14,58 7,72 124,23
Tía tơ- EtOH- 3 6 7,3 5,73 5,57 11,81 7,68 106,02
Gắm- EtOH- 1 6,75 7,36 6,85 6,45 12,21 7,52 78,25
Gắm- EtOH- 2 6,59 6,9 6,22 7,23 12,41 6,98 99,52
Gắm- EtOH- 3 5,60 7,07 6,72 7,7 13,34 6,59 98,51
Hình 20: Hình thái chân chuột trƣớc (a) và sau khi tiêm (b)
3.6. Tình trạng stress oxi hóa của các nhóm chuột
Từ các thí nghiệm trên, nhóm nghiên cứu đã lựa chọn sử dụng các cao chiết ethanol và nƣớc của hai loại dƣợc liệu là tía tơ và dây gắm để thử nghiệm trên mơ hình
chuột. Đối với tía tơ, đây là loại dƣợc liệu có khả năng chống oxi hóa cao ở tất cả các dịch chiết đồng thời cũng không gây độc trên tế bào macrophage RAW264.7, kết quả biểu hiện IL-1β cũng cho thấy tính kháng viêm mạnh của các cao chiết tía tơ. Cịn loại dƣợc liệu thứ hai đƣợc lựa chọn dây gắm, cũng tƣơng tự nhƣ tía tơ, đây là loại dƣợc liệu có tính chống oxi hóa cao và ổn định ở tất cả các dịch chiết, bên cạnh đó, các cao chiết từ dây gắm cũng không gây độc trên tế bào. Kết quả biểu hiện interleukin của các cao chiết dây gắm cũng cho thấy sự ổn định khi thay đổi nồng độ cao chiết sử dụng, đây là một kết quả đáng chú ý và cần các nghiên cứu tiếp sau làm rõ.
Từ đồ thị hình 21, có thể thấy các nhóm đối chứng, nhóm xử lý với colchicine, nhóm DC sinh học và các nhóm uống dịch chiết tía tơ với nƣớc ở nồng độ 50 và 10 mg/kg thể trọng, nhóm uống dịch cao găm và tía tơ với Ethanol ở nồng độ 50 mg/kg thể trọng có lƣợng MDA tƣơng đƣơng nhau (p<0,05). Trong khi đó, các nhóm cịn lại có lƣợng MDA ở gan cao hơn rất nhiều, đặc biệt là nhóm uống dịch cao gắm chiết từ Ethanol ở nồng độ 10 mg/kg thể trọng. Đáng chú ý, mặc dù đƣợc uống các nồng độ khác nhau của dịch chiết dây gắm với nƣớc, tuy nhiên, trạng thái stress oxi hóa các nhóm chuột 7, 8, 9 khơng có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p>0,05), trong khi ở các nhóm uống các dịch chiết khác, trạng thái stress oxi hóa sẽ thay đổi theo nồng độ dịch chiết mà chuột uống. Kết quả này có thể do khả năng chống oxi hóa của UA, giúp làm giảm trạng thái stress oxi hóa của chuột và trạng thái viêm này chỉ mang tính cục bộ và không ảnh hƣởng nhiều đến các cơ quan khác trong cơ thể.
Lƣợng MDA trên màng hồng cầu của nhóm đối chứng sinh học cao hơn các nhóm xử lý với colchicine và dƣợc liệu có thể bắt nguồn từ khả năng chống oxi hóa của cao chiết. Dịch chiết của cả tía tơ và gắm với nƣớc đều cho thấy khả năng chống oxi hóa cao, đặc biệt, các dịch chiết với nƣớc có khả năng chống oxi hóa cao hơn hẳn dịch chiết với ethanol (p<0,05). Từ đó dẫn đến kết quả, trạng thái stress oxi hóa của chuột uống dịch chiết nƣớc của hai loại dƣợc liệu này cũng thấp hơn trạng thái stress oxi hóa của chuột uống cao dịch chiết ethanol.
Việc sử dụng các dịch chiết đã làm giảm stress oxi hóa của chuột ở tất các các dịch chiết và nồng độ. Tuy nhiên, một số dịch chiết lại gây ra trạng thái stress oxi hóa mạnh ví dụ nhƣ nhóm chuột uống cao dịch chiết ethanol dây gắm với nồng độ 10 mg/kg thể trọng và dịch chiết gắm với nồng độ 25 mg/kg thể trọng.
a
b
Hình 21: Biến động lƣợng MDA ở mô gan (a) và màng hồng cầu (b) ở các nhóm chuột
KẾT LUẬN
Từ kết quả nghiên cứu, chúng tôi đƣa ra một số kết luận sau:
1. Xây dựng thành cơng quy trình tạo cao từ một số loại dƣợc liệu gồm Dây gắm là nhỏ (Gnetum parvifolium), Tía tơ (Perilla ocymoides L.), Lá lốt (Piper lolot C.DC.), Thiên niên kiện (Homalomena aromatica (Roxb)), Thổ phục linh (Smilax glabra Roxb.), Dâu tằm (Morus alba L.) với các dung môi nhƣ nƣớc, ethanol, methanol.
2. Các dịch chiết đều có khả năng chống oxi hóa, đặc biệt là cao chiết Lá lốt (Piper lolot C.DC.) từ nƣớc IC50 DPPH là 0,74 mg/ml, cao chiết Tía tơ (Perilla ocymoides L.) từ nƣớc IC50 DPPH là 0,67 mg/ml, cao chiết Thổ phục linh (Smilax glabra Roxb.) từ ethanol IC50 DPPH là 0,8 mg/ml. 3. Hầu hết các cao chiết đều ít gây độc trên dòng tế bào RAW 264.7. Giá trị
LC50 của một số cao chiết đáng chú ý nhƣ tía tơ với nƣớc là 175,90±78,63 mg/ml, dây gắm với ethanol 80 là 122,95±20,52 mg/ml, thổ phục linh với nƣớc là 156,26±50,61 mg/ml, dâu tằm với ethanol là 114,88±1,18 mg/ml. Ngoại trừ cao chiết dâu tằm với nƣớc cho giá trị LC50 là 16,89±9,06 mg/ml.
4. Các cao chiết đều cho thấy tính kháng viêm bởi LPS-MSU tốt, đặc biệt là cao chiết của Tía tơ (Perilla ocymoides L.) bằng Ethanol có khả năng giảm tiết IL-1β ở dịng tế bào RAW 264.7 khoảng 10 lần so với nhóm đối chứng.
KIẾN NGHỊ
Chúng tôi cũng đƣa ra một số kiến nghị sau:
1. Tiếp tục thử nghiệm các dịch chiết thu đƣợc từ dƣợc liệu trị gout của ngƣời Việt với các dung môi và quy trình chiết khác nhau trên các đối tƣợng tế bào và chuột
2. Mở rộng kiểm tra các chỉ tiêu về sinh lý cũng nhƣ sinh hóa, huyết học của động vật mơ hình đế có thể đánh giá đƣợc một cách toàn diện tác động của dịch chiết đối với cơ thể động vật gây viêm bằng MSU (mang bệnh gout).
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt
1 Đặng Kim Thu, Nguyễn Thị Kim Thu., Bùi Thanh Tùng (2017):"Tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase và hạ acid uric máu của dịch chiết lá tía tơ (Perilla frutescens L.)", Tạp chí Dược học, 11, tr. 57.
2 Đỗ Tất Lợi (2004), "Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam", NXB Y học, Hà Nội
3 Lê Hữu Trác (2005), "Hải thượng y tông tâm lĩnh", NXB Y học, Hà Nội 4 Phạm Xuân Sinh (2002), "Dược học cổ truyền", NXB Y học, Hà Nội.
Tài liệu nƣớc ngoài
5 Anthony J. Trevor, Bertram G. Katzung, Marieke Kruidering-Hall (2015),
Katzung & Trevor’s Pharmacology: Examination & Board Review. 11 ed.,
McGraw-Hill Education, United States 6 ATCC: "RAW 264.7 (ATCC® TIB-71™)"
7 Bartłomiej Taciak, Maciej Białasek, Agata Braniewska, Zuzanna Sas, Paulina Sawicka, Łukasz Kiraga, Tomasz Rygiel, Magdalena Kro (2018): "Evaluation of phenotypic and functional stability of RAW 264.7 cell line through serial passages", PLOS One, 13(6), e0198943
8 Bauernfeind F, Bartok E, Rieger A, Franchi L, Núñez G, Hornung V (2011), "Cutting edge: reactive oxygen species inhibitors block priming, but not activation, of the NLRP3 inflammasome", The Journal of Immunology, 187
(2), pp. 613-617.
9 Biomodels: Fast, Innovative, Predictive: "Gout"
10 Chen LX, Schumacher HR (2008), "Gout: An Evidence-Based Review",
Journal of Clinical Rheumatology, 14(5 Suppl):S55-62.
11 Chiarantini L, Cerasi A, Giorgi L, Formica M, Ottaviani MF, Cangiotti M, Fusi V (2003), "Dinuclear copper(II) complex as nitric oxide scavenger in a stimulated murine macrophage model", Bioconjugate Chemistry, 14(6), pp.
12 Congbing F, Wan X, Changjun J, Haiqun C (2005), "Comparison of HPTLC and HPLC for Determination of Isoflavonoids in Several Kudzu Samples",
Journal of Planar Chromatography, 18, pp. 73-77.
13 Cronstein BN, Sunkureddi P. (2013), "Mechanistic Aspects of Inflammation and Clinical Management of Inflammation in Acute Gouty Arthritis", Journal
of Clinical Rheumatology, 19 (1), pp.19-29.
14 Dalbeth N, Lauterio TJ, Wolfe HR (2014), "Mechanism of Action of Colchicine in the Treatment of Gout", Clinical Therapeutics, 36 (10), pp.
1465-1479.
15 Dalbeth N, Merriman TR, Stamp LK (2016), "Gout", The Lancet, 388
(10055), pp.2039–2052.
16 Ferraz-Filha ZS, Fernanda CF., Araújo MCPM, Bernardes ACFPF, Saúde- Guimarães DA (2017), "Effects of the Aqueous Extract from Tabebuia roseoalba and Phenolic Acids on Hyperuricemia and Inflammation",
Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2017.
17 Hanif JK, Adrian WSH,Federica L, Heidi D, Matheswaran K, Baalasubramanian S, Gim GT, Alessandra M (2017), "C5a Regulates IL-1β Production and Leukocyte Recruitment in a Murine Model of Monosodium Urate Crystal-Induced Peritonitis", Frontiers in Pharmacology, 8
18 Hoffstein S, Weissmann G (1975), "Mechanisms of lysosomal enzyme release from leukocytes. IV. Interaction of monosodium urate crystals with dogfish and human leukocytes", Arthritis & Rheumatology , (18), pp. 153-
165.
19 Huo LN, Wang W, Zhang CY, Shi HB, Liu Y, Liu XH, Guo BH, Zhao DM, Gao H (2015), "Bioassay-Guided Isolation and Identification of Xanthine Oxidase Inhibitory Constituents from the Leaves of Perilla frutescens",
Molecules, 20, pp. 17848-17859
20 Iyer SS, He Q, Janczy JR, Elliott EI, Zhong Z, Olivier AK, Sadler JJ, Knepper-Adrian V, Han R, Qiao L, Eisenbarth SC, Nauseef WM, Cassel SL, Sutterwala FS (2013), "Mitochondrial cardiolipin is required for Nlrp3
inflammasome activation", Immunity, 39 (2), pp. 311-323.
21 John R. W. Masters (2000), Animal Cell Culture: A Practical Approach,
Oxford University Press, United State
22 Joon-Kwan Moon, Takayuki Shibamoto (2009): "Antioxidant Assays for Plant and Food Components", Journal of Agricultural and Food Chemistry,
57, pp. 1655-1666
23 Konno H, Kanai Y, Katagiri M, Watanabe T, Mori A, Ikuta T, Tani H, Fukushima S, Tatefuji T, Shirasawa T (2013), "Melinjo (Gnetum gnemon L.) Seed Extract Decreases Serum Uric Acid Levels in Nonobese Japanese Males: A Randomized Controlled Study", Evidence-Based Complementary
and Alternative Medicine, 2013, 589169
24 Lin D, Xiao M, Zhao J, Li Z, Xing B, Li X, Kong M, Li L, Zhang Q, Liu Y, Chen H, Qin W, Wu H, Chen S (2016), "An Overview of Plant Phenolic Compounds and Their Importance in Human Nutrition and Management of Type 2 Diabetes", Molecules, 21 (10), pp. 1374-1393.
25 Liu JY, Chen YC, Lin CH, Kao SH (2013), "Perilla frutescens leaf extract inhibits mite major allergen Der p 2-induced gene expression of pro-allergic and pro-inflammatory cytokines in human bronchial epithelial cell BEAS- 2B", PLOT One, 8(10), e77458
26 Lu CL, Zhu W, Wang M, Xu XJ, Lu CJ (2014), "Antioxidant and Anti- Inflammatory Activities of Phenolic-Enriched Extracts of Smilax glabra",
Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2014, 910438
27 Maria de Lourdes Reis Giada (2012): "Food Phenolic Compounds: Main Classes, Sources and Their Antioxidant Power", Intechopen
28 Meng ZQ, Tang ZH, Yan YX, Guo CR, Cao L, Ding G, Huang WZ, Wang ZZ, Wang KD, Xiao W, Yang ZL (2014), "Study on the Anti-Gout Activity of Chlorogenic Acid: Improvement on Hyperuricemia and Gouty Inflammation", The American Journal of Chinese Medicine, 42 (6), pp. 1471- 1483.
in Tissues by Thiobarbituric Acid Test", Analytical Biochemistry, 86, pp.
271-278.
30 Min HK, Kim SM, Baek SY, Woo JW, Park JS, Cho ML, Lee J, Kwok SK, Kim SW, Park SH (2015),"Anthocyanin Extracted from Black SoybeaSeed Coats Prevents Autoimmune Arthritis by Suppressing the Development of Th17 Cells and Synthesis of Proinflammatory Cytokines by Such Cells, via Inhibition of NF-κB", PLOS One, 10 (11), e0138201.
31 Mufeed JE, Maha FS, Ali MJ, Samr M, Osama MA, Muna ME (2015), "Using Soursop Extracts for Natural Gout Treatment", American Journal of
Bioscience and Bioengineering, 3 (5), pp. 37-39.
32 Nakahira K, Haspel JA, Rathinam VA, Lee SJ, Dolinay T, Lam HC, Englert JA, Rabinovitch M, Cernadas M, Kim HP, Fitzgerald KA, Ryter SW, Choi AM (2011), "Autophagy proteins regulate innate immune responses by inhibiting the release of mitochondrial DNA mediated by the NALP3 inflammasome", Nature Immunology ,12 (3), pp. 222-230.
33 Nguyen MT, Awale S, Tezuka Y, Tran QL, Watanabe H, Kadota S (2004), "Xanthine Oxidase Inhibitory Activity of Vietnamese Medicinal Plants",
Biological and Pharmaceutical Bulletin, 27 (9), pp. 1414-1421.
34 Shimada K, Crother TR, Karlin J, Dagvadorj J, Chiba N, Chen S, Ramanujan VK, Wolf AJ, Vergnes L, Ojcius DM, Rentsendorj A, Vargas M, Guerrero C, Wang Y, Fitzgerald KA, Underhill DM, Town T, Arditi M. (2012), "Oxidized mitochondrial DNA activates the NLRP3 inflammasome during apoptosis",
Immunity, 36 (3), pp. 401-414.
35 Su Jung Hwang, Yong-Wan Kim, Yohan Park, Hyo-Jong Lee, Kyu-Won Kim (2014): "Anti-inflammatory effects of chlorogenic acid in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 cells", Inflammation Research,63, pp. 81-90
36 Sunkureddi P (2011), "Gouty Arthritis: Understanding the Disease State and Management Options in Primary Care", Advances in Therapy, 28(9), pp.748- 760.
37 Torres R, Macdonald L, Croll SD, Reinhardt J, Dore A, Stevens S, Hylton DM, Rudge JS, Liu-Bryan R, Terkeltaub RA, Yancopoulos GD, Murphy AJ (2009), "Hyperalgesia, synovitis and multiple biomarkers of inflammation are suppressed by interleukin 1 inhibition in a novel animal model of gouty arthritis", Annals of the Rheumatic Diseases, 68, pp. 1602-1608.
38 Vermerris W, Nicholson R (2006), Phenolic compound biochemistry,
Springer, United State.
39 Wen D, L. C., Di H, Liao Y, Liu H. (2005), "A Universal HPLC Method for the Determination of Phenolic Acids in Compound Herbal Medicines",
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53 (17), pp. 6624-6629.
40 Yao L, Dong W, Lu F, Liu S (2012), "An improved acute gouty arthritis rat model and therapeutic effect of rhizoma Dioscoreae nipponicae on acute gouty arthritis based on the protein-chip methods", The American Journal of Chinese Medicine, 40 (1), pp. 121-134.
41 Yonglin Gao, Wanglin Jiang, Chaohua Dong, Chunmei Li, Xuejun Fu, Li Min, Jingwei Tian, Haizhu Jin, Jingyu Shen (2011):"Anti-inflammatory effects of sophocarpine in LPS-induced RAW 264.7 cells via NF- jB and MAPKs signaling pathway", Toxicology in Vitro, 26, pp. 1-6
PHỤ LỤC
A. PHỔ HẤP THỤ CÁC DỊCH CHIẾT
Dịch chiết với Ethyl Acetate của Dây gắm lá nhỏ Dịch chiết với n-Hexane của Dây gắm lá nhỏ
Dịch chiết với Ethanol 60 của Dây gắm lá nhỏ
Dịch chiết với Methanol của Dây gắm lá nhỏ
Dịch chiết với Methanol của Lá lốt Dịch chiết với nƣớc của Lá lốt
Dịch chiết với nƣớc của Thiên niên kiện Dịch chiết với Ethanol của Tía tơ
B. KẾT QUẢ SẮC KÝ BẢN MỎNG TLC CÁC DỊCH CHIẾT Dịch chiết Lá lốt với: 1. Blank 2. Nƣớc 3. Ethanol 4. Methanol Dịch chiết Tía tơ với: 1. Ethanol 2. Nƣớc 3. Methanol 4. Blank Dịch chiết Dây gắm lá nhỏ với: 1. Blank 2. n-Hexane 3. Ethyl acetate 4. Methanol Dịch chiết Dây gắm lá nhỏ với: 1. Ethanol 100 2. Ethanol 80 3. Ethanol 60 4. Nƣớc Dịch chiết Thiên niên kiện với: 1. Nƣớc 2. Ethanol 3. Methanol 4. Blank Dịch chiết Dâu tằm với: 1. Nƣớc 2. Ethanol 3. Methanol 4. Methanol Dịch chiết Thổ phục linh với: 1. Nƣớc 2. Ethanol 3. Methanol 4. Nƣớc
C. SẮC KÝ ĐỒ HPLC
Sắc ký đồ dịch chiết nƣớc của Dâu tằm ở các bƣớc sóng 254nm, 275nm, 305 nm và phổ phát huỳnh quang
Sắc ký đồ dịch chiết nƣớc của Dây gắm ở các bƣớc sóng 254nm, 275nm, 305 nm và phổ phát huỳnh quang
.
Sắc ký đồ dịch chiết Methanol của Lá lốt ở các bƣớc sóng 254nm, 275nm, 305 nm và phổ phát huỳnh quang