3.4.1. Thử nghiệm độc tính của các dịch chiết lên dịng tế bào RAW 264.7
Trƣớc khi thử nghiệm các dịch chiết đƣợc tạo cao cô đặc bằng phƣơng pháp cô quay chân khơng và pha lỗng trở lại với nƣớc trƣớc khi đƣợc thử trên tế bào và trên chuột. Hình ảnh sắc ký TLC của các cao dịch chiết cho thấy các cao dịch chiết của tía tơ đều xuất hiện các băng huỳnh quang và rất ít băng phụ, các băng huỳnh quang này có vị trí tƣơng đồng với các băng huỳnh quang thu đƣợc khi chạy sắc ký TLC với dịch chiết ban đầu (Hình 16). Các cao chiết với dây gắm cũng xuất hiện 1 băng huỳnh quang mờ ở phía gần điểm dừng, tuy nhiên, các cao dây gắm đều có chấm huỳnh quang ở điểm chạy, điều này cho thấy vẫn còn một số hoạt chất sau khi đƣợc tạo cao không thể phân tách đƣợc với pha động đƣợc sử dụng.
Hình 16: Kết quả sắc ký TLC với các cao dịch chiết và dịch chiết ban đầu
Bản 1
Giếng 1: Blank
Giếng 2: Dịch chiết tía tơ với nước Giếng 3: Dịch chiết tía tơ với nước Giếng 4: Dịch chiết tía tơ với ethanol
Bản 2
Giếng 1: Blank
Giếng 2: Cao tía tơ chiết với nước Giếng 3: Cao tía tơ chiết với ethanol Giếng 4: Cao dây gắm chiết với nước
Kết quả thí nghiệm MTT trên dòng tế bào RAW 264.7 sau khi đã thử với các loại dịch chiết cho thấy, nhiều dịch chiết không ảnh hƣởng đến khả năng sống của tế bào (Hình 17). Ví dụ nhƣ dịch chiết nƣớc của tía tơ, ở các nồng độ từ 0,625 mg/ml, 1,25 mg/ml, 2,5 mg/ml, 5 mg/ml và 10 mg/ml đều không ảnh hƣởng tới khả năng sống của tế bào, nồng độ này tƣơng đƣơng với việc tế bào đƣợc xử lý với 10 mg, 5 mg, 2,5 mg và 1,25 mg trên 1x104
tế bào. Cụ thể, tỷ lệ tế bào sống ở các nồng độ này dao động từ 98% - 100%, trong khi đó, ở nồng độ 10 mg/ml, tỷ lệ tế bào sống giảm xuống chỉ còn khoảng từ 73-79%, khác biệt hẳn với nhóm có nồng độ dƣới 5 mg/ml (p<0,05).
Tỷ lệ sống của các nhóm tế bào đƣợc thử với cao dịch chiết ethanol của tía tơ khơng có sự thay đổi nhiều với p>0,05. Tƣơng tự nhƣ vậy, khi thay đổi nồng độ cao dịch chiết methanol của tía tơ trên tế bào cũng khơng làm thay đổi nhiều về tỷ lệ sống (p<0,05), tuy nhiên, khác với cao dịch chiết ethanol, tỷ lệ tế bào sống chỉ khoảng 80% thì cao dịch chiết methanol đều cho tỷ lệ sống của tế bào trên 90% ở đa số các nồng độ đƣợc thử nghiệm. Từ các số liệu trên có thể xác định đƣợc giá trị LC50 của các cao dịch chiết, đáng chú ý, theo tính tốn, dịch chiết nƣớc của tía tơ có giá trị LC50 cao nhất trong tất cả các dịch chiết, lên tới 175,90±78,63 mg/ml.
Đối với dịch chiết dây gắm, có thể thấy loại dƣợc liệu có độc tính thấp với tế bào RAW246.7 trên cả 3 loại dung môi chiết. Cụ thể, dịch chiết với methanol, tỷ lệ tế bào sống chỉ đạt 39% ở nồng độ 10 mg/ml, sau đó tăng lên 55% ở nồng độ 5 mg/ml và 95% ở nồng độ 2,5 mg/ml. Dịch chiết với ethanol cũng tƣơng tự, chỉ có ~55% tế bào sống sau khi xử lý với dịch chiết nồng độ 10 mg/ml, cũng ở cùng nồng độ này, chỉ có 48% tế bào sống sau khi xử lý với dịch chiết nƣớc. Tuy nhiên, tỷ lệ tế bào sống đã tăng lên khi giảm nồng độ dịch chiết. Cụ thể, đối với dịch chiết với nƣớc, tỷ lệ tế bào sống tăng lên tới 91% khi giảm nồng độ xuống cịn 5 mg/ml. Tiếp tục phân tích kết quả cho thấy, giá trị LC50 của cao dịch chiết ethanol 80 của dây gắm rất cao, lên tới 122,95±20,52 mg/ml.
Các dịch chiết của thổ phục linh đều gây ra sự giảm mạnh về tỷ lệ sống của tế bào. Cụ thể, đối với dịch chiết nƣớc, các tế bào có tỷ lệ sống cao nhất là 84% ở nồng độ 2,5 mg/ml và thấp nhất ở nồng độ 5 mg/ml (64%). Đối với cao chiết ehtanol, tỷ lệ này cũng chỉ duy trì trong khoảng từ 73%-88% và chỉ đạt giá trị cao nhất đến 99% ở nồng độ 1,25 mg/ml. Đáng chú ý, dịch chiết với nƣớc của thổ phục linh có giá trị LC50 rất cao, lên đến 156,26±50,61 mg/ml, đồng thời, cao chiết ethanol cũng có LC50 lên đến 87,80±8,38 mg/ml.
Ở các mẫu dịch chiết dâu, kết quả cho thấy, ở dịch chiết với nƣớc, khi giảm nồng độ dịch chiết sử dụng, lƣợng tế bào sống cũng đồng thời giảm theo, từ 100% xuống còn 36% khi giảm nồng độ từ 10 mg/ml xuống 0,625 mg/ml, xu hƣớng này khác hẳn với tất các dịch chiết của các dƣợc liệu đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này. Ở cao chiết ethanol, tỷ lệ sống của tế bào tăng dần theo chiều giảm nồng độ dịch chiết sử dụng, từ 54% lên đến cao nhất là 100%. Từ các tính tốn sau đó, giá trị LC50 của các dịch chiết nƣớc và cao chiết ethanol của dâu tằm cũng khá cao, lần lƣợt là 16,89±9,06 mg/ml và 114,88±1,18 mg/ml (Hình 18). Từ thí nghiệm này, có thể thấy đa số các cao chiết của các loại dƣợc liệu đƣợc chọn đều ít gây độc trên tế bào với giá trị LC50 lớn hơn 10 mg/ml, ngoại trừ cao chiết của dâu tằm với nƣớc và cao chiết ethanol của thổ phục linh.
Từ kết quả đánh giá khả năng chống oxi hóa và độc tính trên tế bào RAW 264.7, nhóm nghiên cứu đã chọn lựa các cao chiết và nồng độ phù hợp để tiếp tục thử nghiệm trên mơ hình tế bào và chuột, cụ thể gồm cao chiết tía tơ với nƣớc, ethanol; cao chiết dây gắm với nƣớc và ethanol 80%.
Hình 17: Ảnh hƣởng của cao dịch chiết lên tế bào RAW 264.7
a. Đối chứng sinh học b. Cao chiết nước tía tơ c. Cao chiết nước lá lốt
d. Cao chiết nước dây gắm e. Cao chiết nước thổ phục linh f. Cao chiết nước dâu tằm
3.4.2. Biểu hiện IL-1β dưới sự kích thích của MSU và LPS
Từ bảng 8 cho thấy, đối với nhóm tế bào đƣợc xử lý chỉ với LPS hoặc MSU, lƣợng IL-1β tăng lên khơng đáng kể so với nhóm đối chứng, cụ thể, đối với nhóm chỉ xử lý với LPS, IL-1β chỉ tăng 4% so với nhóm đối chứng với p>0,05. Tƣơng tự, nhóm chỉ đƣợc xử lý với MSU, biểu hiện IL-1β cũng chỉ tăng 6% so với đối chứng với p<0,05, cho thấy, tinh thể MSU cũng đã kích thích gây viêm trên tế bào nhƣng với lƣợng khơng đáng kể. Đáng chú ý, nhóm đƣợc gây viêm bằng cả LPS và MSU, biểu hiện IL-1β tăng 53,2% so với nhóm đối chứng và sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p<0,05. Kết quả này cũng tƣơng tự nhƣ nghiên cứu của Hanif và cs (2017) khi thí nghiệm kiểm chứng khả năng điều hịa IL-1β của C5a. Mơ hình thí nghiệm của nhóm cũng sử dụng LPS và MSU để gây viêm cho tế bào, kết quả biểu hiện IL- 1β cho thấy, đối với nhóm chỉ sử dụng LPS, khả năng biểu hiện interleukin khơng có sự khác biệt so với các tế bào đối chứng. Tuy nhiên, khi có sự kết hợp giữa LPS và MSU, lƣợng IL-1β đƣợc giải phóng tăng đột biến và cao hơn so với nhóm đối chứng [17].
Bảng 8: Biểu hiện IL-1β ở các nhóm tế bào
STT Nhóm Biểu hiện IL-1β p
1 LPS 1,039±0,027 0,316
2 MSU 1,063±0,008 0,002
3 LPS+MSU 1,532±0,30 0,002
4 Đối chứng sinh học 1
3.4.3. Biểu hiện IL-1β khi thử nghiệm với các dịch chiết
Trong thí nghiệm này, đối chứng âm đƣợc sử dụng là các tế bào đƣợc ni cấy bình thƣờng và đƣợc gây viêm (ký hiệu là nhóm LPS-MSU nhƣ trong hình 19), nhóm đối chứng dƣơng đƣợc sử dụng là nhóm tế bào đƣợc gây viêm và xử lý với colchicine. Nhóm đối chứng sinh học là nhóm khơng đƣợc gây viêm và khơng đƣợc xử lý với bất kỳ loại thuốc hay dƣợc liệu nào.
Kết quả ELISA hình 19 cho thấy, trạng thái viêm của nhóm đối chứng cao hơn so với nhóm đối chứng sinh học và sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với
p<0,05. Trong khi đó, nhóm tế bào xứ lý với colchicine cho thấy trạng thái viêm giảm mạnh và có sự khác biệt với nhóm đối chứng (p<0,05) . Tƣơng tự, khi tế bào đƣợc xử lý với dịch chiết nƣớc của tía tơ với các liều lƣợng đều cho thấy khả năng làm giảm biểu hiện của IL-1β mạnh và tƣơng đƣơng nhóm xử lý với colchicine, đặc biệt là nhóm đƣợc xử lý với dịch chiết nồng độ 10 mg/ml (p>0,05). Đối với nhóm xử lý với cao chiết ethanol của tía tơ nồng độ 10 mg/ml, IL-1β biểu hiện thấp hơn tất cả các nhóm, bao gồm cả nhóm đối chứng sinh học và nhóm xử lý với colchicine. Tuy nhiên, ở nhóm xử lý với cao chiết ethanol của tía tơ nồng độ 2 mg/ml, biểu hiện IL-1β cao tƣơng đƣơng với nhóm đối chứng. Điều này cho thấy, ở nồng độ này, cao chiết ethanol của tía tơ đã khơng phát huy đƣợc đặc tính kháng viêm của mình. Trong khi đó, đối với những nhóm tế bào xử lý với cao chiết ethanol của dây gắm, ở các nồng độ đều cho thấy biểu hiện của IL-1β có sự tăng nhẹ và tƣơng đối đồng đều (p>0,05). Kết quả ở các nhóm xử lý với dịch chiết nƣớc dây gắm với nồng độ 10 và 2 mg/ml đều ghi nhận sự giảm mạnh về trạng thái viêm (p<0,05), thậm chí ở 2 nhóm này, IL-1β cịn biểu hiện thấp hơn cả nhóm đối chứng sinh học (p<0,05). Tuy nhiên, ở nhóm xử lý với dịch chiết nƣớc của dây gắm nồng độ 5 mg/ml, biểu hiện của interleukin cao lên tƣơng đƣơng với nhóm đối chứng và khác biệt hẳn so với hai nhóm cịn lại (p<0,05). Kết quả ELISA này cũng tƣơng tự kết quả nghiên cứu của Liu và cs (2013). Nhóm đã nghiên cứu sự biểu hiện của các interleukin tiền viêm và tiền dị ứng nhƣ IL-6, IL-8, IL-4, IL-5, IL-13. Kết quả cho thấy, các interleukin tiền viêm đều tăng mạnh trên các dòng tế bào đƣợc xử lý với dịch chiết tía tơ với nồng độ tăng dần. Điểm đáng chú ý là đối chứng của nghiên cứu này có biểu hiện interleukin tƣơng đƣơng với nhóm đối chứng sinh học, và biểu hiện này có xu hƣớng giảm dần theo chiều tăng của liều lƣợng tía tơ sử dụng. Các tác giả cũng chỉ ra liên hệ giữa kết quả phân tích m-RNA và ELISA, khi mRNA của các interleukin của đối chứng và đối chứng sinh học tƣơng đƣơng nhau, trong khi ở các nhóm xử lý với dịch chiết tía tơ, lƣợng mRNA lại tăng lên rất nhiều [25].
Thí nghiệm đã chứng minh đƣợc tính kháng viêm mạnh của tất cả các cao chiết tía tơ đƣợc sử dụng.