Chương 3: SẮC KÍ LỎNG
3.2.5. Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao
Các cột sử dụng trong HPLC được làm bằng vật liệu thép không rỉ (thép Cr-Ni-Mo) với mặt trong của cột được làm nhẵn.
Kích thước phổ biến của một cột là đường kính ngồi bằng 6.35 mm (1/4 in.), 4.6 mm đường kính trong, và chiều dài nhiều cởđến 25 cm.
Cột được nhồi các hạt có cởđường kính 3, 4, 5, 10 µ m. Chất nhồi trong cột thường là silicagen hoặc silicagen có bọc hoặc gắn hóa học một màng mỏng chất hữu cơ. Bên cạnh silicagen người ta còn dùng Al2O3, hạt polime xốp, hạt chất trao đổi ion.
Bộ lọc tiền cột / cột bảo vệ
Sau bộ phận tiêm mẫu và trước cột tách cần phải lắp cột bảo vệ (hay bộ lọc tiền cột) giúp bảo vệ những cột đắt tiền khỏi sự xâm nhập của của các hạt bẩn nhỏ có thể có trong dung mơi và trong mẫu tiêm vào.
Cột bảo vệ không làm thay đổi hiệu quả tách của cột. Nó được thiết kế với một thể tích tổng cộng tương đối nhỏ và thể tích chết nhỏ, nhờ vậy khơng làm dỗng pic.
Cột bảo vệđược đổđầy các hạt nhồi tráng phim mỏng hoặc có pha liên kết như trong cột phân tích.
Cột bảo vệ có một dung lượng xác định cho chất nhiễm bẩn. Số lần tiêm mẫu, sự suy giảm của hình dáng pic hoặc độ phân giải là dấu hiệu cần phải thay cột bảo vệ.
Chức năng của detector trong HPLC là giám sát pha động đi ra từ cột phân tích. Tín hiệu ra của detector là tín hiệu điện tỉ lệ thuận với với một vài tính chất của pha động hoặc của chất tan trong mẫu.
Có khá nhiều thiết bị được ứng dụng làm detector trong HPLC. Những đặc trưng quan trọng của detector trong HPLC là:
nhạy
tuyến tính
đáp ứng (respond) chọn lọc hoặc thông dụng
đáp ứng không bịtác động bởi những thay đổi của các điều kiện
thể tích chết thấp
khơng dễ bị phá hủy
rẻ tiền, đáng tin cậy và dễ sử dụng.
Khơng có detector nào có thể sở hữu tất cả những đặc trưng trên và chúng khơng hồn toàn độc lập với nhau nên cải thiện một đặc tính của nó có thể làm tồi thêm cái kia.
Bất kỳ một detector nào cũng chịu tiếng ồn của thiết bị, chủ yếu là phần điện, độ lớn của nó xác định lượng chất hịa tan nhỏ nhất có thểđược dị tìm. Bởi vì khi ta giảm lượng chất phân tích đến một giá trịnào đó thì tín hiệu từ detector sẽ q nhỏ để có thể phân biệt nó với tiếng ồn của detector.
Độ nhạy của detector thường được xem như nồng độ tạo ra tín hiệu cởnhư tín hiệu tạo ra bởi tiếng ồn.
Một detector tuyến tính có tín hiệu tỷ lệ thuận với lượng hoặc nồng độ của chất tan. Khoảng tuyến tính của detector chính là khoảng nồng độ mà sự tuyến tính này tuân theo.
Giới hạn phát hiện cho biết lượng tối thiểu của cấu tử có thểđược thấy một cách đáng tin cậy trên sắc ký đồ. Về mặt thực nghiệm giới hạn dị tìm của một chất là lượng chất đó cho một pic gấp vài lần tiếng ồn của nền (thường 3 lần).
Một detector vạn năng thì nhạy với mọi thứ có trong mẫu ví dụ detector khối phổ, cịn một detector chọn lọc thì chỉ nhạy với một vài cấu tửnào đó như detector ECD nhạy với hợp chất chứa halogen. Kiểu detector Đáp ứng Mức ồn Giới hạn phát hiện (g/cm3) Thể tích flowcell (μl) UV-VIS Huỳnh quang Đo độ dẫn Đo chỉ số khúc xạ Chọn lọc Chọn lọc Chọn lọc Phổ thông 10-4 a.u 10-7 a.u 10-2μS/cm 10-7 r.i.u 10-8 10-12 10-7 10-6 1-8 8-25 1-5 5-15