Chương 3: SẮC KÍ LỎNG
3.3.5. Sắc kí loại theo cở (Size Exclusion Chromatography)
Sắc kí loại theo cở hay cịn gọi là sắc kí trên gel là một cơng cụ mạnh cho phân tích các chất có khối lượng phân tử lớn.
Chất nhồi cột cho sắc kí này là các hạt nhỏ (cở 10 micromet) polime hoặc silica chứa mạng lưới các lỗ đồng nhất trong đó các chất tan và dung mơi có thể khuếch tán vào. Trong các lỗ đó các phân tử bị bẫy một cách hiệu quả và bị tách từ dòng chảy của pha động.
Thời gian cư ngụ trung bình trong các lỗ phụ thuộc vào kích thước hiệu dụng của các phân tử. Các phân tửcó kích thước lớn hơn so với kích thước trung bình của các lỗ của chất nhồi thì khơng bịlưu giữ.
Cịn các phân tử có đường kính nhỏ hơn đáng kể kích thước lỗ thì thâm nhập càng sâu vào trong sâu lỗ và như vậy cần nhiều thời gian hơn để ra khỏi lỗ, dẫn đến bị rửa giải ra sau cùng.
Nằm giữa hai loại này là các phân tửcó kích thước trung bình sẽ xâm nhập vào trong các lỗ nhiều hay ít tùy thuộc đuồng kính của chúng.
Chất nhồi cột
Có hai loại: Các hạt polime và silica có đường kính từ5 đến 10 micromet. Loại sau cứng hơn nên dễ nhồi cột, bền hơn, cho phép sử dụng một khoảng rộng các dung môi bao gồm cảnước, cân bằng thiết lập nhanh hơn trong những dung môi mới, và bền ở nhiệt độ cao hơn.
Những nhược điểm của hạt silica là có khuynh hướng lưu giữ chất tan bởi sự hấp phụ và có thể có tiềm năng xúc tác cho các phản ứng phân hủy các phân tử chất tan.
Hầu hết sắc kí loại theo cởđầu tiên được thực hiện trên chất nhựa đồng trùng hợp giữa divinyl benzene với styrene. Kích thước lỗ của loại polime này được kiểm soát bởi sự mở rộng liên kết ngang và vì thế liên quan đến phần trăm divinylbenzen sử dụng để sản xuất nhựa. Vì vậy có nhiều loại gel với kích cở lỗ khác nhau.
Lúc đầu, các nhựa đồng trùng hợp này là kỵ nước và chỉ được sử dụng với pha động là các dung môi không nước.
Hiện nay, các gel ưa nước là có sẵn (ví dụ poliacrylamide) dẫn dến có thể sử dụng dung mơi nước cho các phép tách các phân tử chất tan trong nước ví dụ các loại đường.
Các loại silica và hạt thủy tinh có kích thước lỗ trung bình của khoảng 40 đến 2500 Ao hiện có sẵn trên thịtrường. Để giảm sự hấp phụ, bề mặt của những chất này thường được chuyển hóa bởi những chất thế hữu cơ. Ví dụ bề mặt của một chất nhồi ưa nước có cấu trúc: OH OH │ │ │ —Si—CH2—CH2—CH2—CH2—O—CH2—CH—CH2 │ Phương trình rửa giải:
Trong sắc kí theo gel thể tích của pha động Vm thường được gọi là thể tích rỗng (Void volume) Vo. Đại lượng Kav được định nghĩa là:
Kav = (Vr – Vo)/(Vt - Vo) Ởđây
o Vr là thểtích lưu của một chất tan,
o Vt là thể tích tổng của cột = πr2
với r là bán kính).
o Đối với một phân tử lớn và khơng xâm nhập vào gel thì Vr = Vo và Kav = 0.
o Đối với các phân tử nhỏ xâm nhập tự do vào gel thì Vr≈ Vt và Kav ≈ 1.
o Các phân tửcó kích thước trung bình xâm nhập một phần vào các lỗ thì có Kav nằm trong khoảng từ0 đến 1. Thực tế do ln ln có sự hấp phụ nên Kav ln ln lớn hơn 1.
Thể tích rỗng được đo bởi cho một loại phân tửtrơ có kích thước lớn đi qua cột. Thể tích rửa giải của nó chính là Vo.
Hình 3.4: Sơ đồ cấu trúc một poliacrylamide
3.4. Pha động