Như vậy, fucoidan là tập hợp của rất nhiều mảnh cấu trúc khác nhau, không phải là tập hợp của các phân tử đồng nhất như nhau, việc mơ tả hồn chỉnh cấu trúc của fucoidan là việc vơ cùng khó. Đã có nhiều cơng trình nghiên cứu nhằm xác định cấu trúc của fucoidan đã được cơng bố, nhưng mới chỉ có một vài kết quả nghiên cứu phát hiện được tính quy luật trong cấu trúc của fucoidan.
1.2.3. Hoạt tính sinh học của fucoidan
1.2.3.1. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng virus
năng ức chế đáng kể sự phát triển của khuẩn Gram dương (Gr(+)) và Gram âm (Gr(-)), đồng thời kích thích hệ thóng miễn dịch bằng cách tăng cường thực bào (tế bào nuốt và tiêu hóa vi khuẩn).
Trong những năm gần đây, các thử nghiệm về hoạt tính kháng virus của fucoidan đã được thực hiện bằng cả “in vitro” và “in vivo” và cho thấy yếu tố gây độc tế bào thấp của chúng so với các thuốc kháng virus khác đang được quan tâm thử nghiệm trong y học lâm sàng. Các nghiên cứu cho thấy fucoidan kích thích khả năng tạo ra các dạng interleukin và interferon được tiết ra nhờ các tế bào miễn dịch giống tế bào T, từ đó kích hoạt các tế bào miễn dịch khác nhau (T-cells, NK-cells, macrophage-đại thực bào) cần thiết để phòng nhiễm trùng và bệnh tật. Các nhà khoa học tin rằng, fucoidan có thể đem lại một sự điều trị hiệu quả chống lại các virus viêm gan, mệt mãn tính và thậm chí ngay cả virus HIV [9][32][33].
1.2.3.2. Hoạt tính chống oxy hóa
Một số cơng bố đã cho rằng fucoidan thể hiện hoạt tính chống oxy hóa quan trọng trong các thí nghiệm “in vitro”, fucoidan có thể làm mất gốc peroxide hiệu quả, ảnh hưởng của nó lên gốc hidroxyl là yếu và ít có ảnh hưởng trên 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH). Điều đó cho thấy fucoidan là một chất chống oxy hóa tự nhiên tốt, giúp ngăn ngừa các bệnh gây ra bởi các gốc tự do. Một số thử nghiệm trên chuột nhận thấy fucoidan thu được từ L. japonica có thể ngăn chặn sự tăng peroxide lipid trong huyết thanh gan, lá lách của chuột bị tiểu đường một cách rõ ràng. Trong một nghiên cứu khác, Michiline và cộng sự cũng công bố rằng fucoidan (homofucan) từ
F.vesiculosus và fucan (heterofucans) từ Padina gymnospora đã có tác dụng
ức chế sự hình thành gốc tự do hidroxyl và gốc peroxide, trong đó fucan cho thấy hoạt tính chống oxy hóa thấp hơn so với fucoidan [2][34].
1.2.3.3. Hoạt tính kháng u và điều hòa miễn dịch
Năm 1990, Noda, Hiroyuki, Amano và các cộng sự đã sàng lọc trên 46 lồi rong ở dạng bột, khơ tự nhiên trong khơng khí (trong đó có 4 lồi rong lục, 21 lồi rong nâu, 21 lồi rong đỏ). Hoạt tính chống ung thư biểu mơ dạng
Ehrlich được thấy có ở rong nâu Scytosiphon lomentaria (ngăn chặn 69.8%), Lessonia nigrescens (60.0%), Laminaria japonica (57.6%), Sargassum ringgoldianum (46.5%), rong đỏ Porphyra yezoensis (53.2%), Eucheuma gelatinae (52.1%) và rong lục Enteromorpha prolifera (51.7%). Năm loài
rong nâu và bốn loài rong đỏ có tác dụng chống ung thư dạng Meth-A fibrosarcoma[35]. Ba năm sau cũng nhóm tác giả này tiến hành chiết các hợp chất trong rong nâu theo 31 phân đoạn từ trung tính đến axit, đem thử hoạt tính kháng ung thư và họ nhận ra rằng hai phân đoạn có khối lượng phân tử trung bình khoảng 13500Da và 19000Da có hoạt tính kháng ung thư. Các fucoidan này đã tương tác trực tiếp với tế bào ung thư và tiêu diệt chúng, cả hai phân đoạn đều không tan trong nước và phải chiết ra bằng axit nóng. Bằng các phương pháp phân tích hố học cũng như các phương pháp phổ cơ bản họ đã chứng minh được các hợp chất này chính là fucoidan [36].
Sự suy yếu trong hệ thống kiểm soát miễn dịch dẫn đến các tế bào ung thư phát triển không nhận biết được. Fucoidan phục hồi lại các tế bào phòng vệ miễn dịch và như vậy, chúng có thể trở nên cảnh giác hơn trong việc nhằm vào các tế bào khác thường để phá hủy. Hệ miễn dịch vừa là hàng rào phòng thủ đầu tiên và vừa là cuối cùng chống lại ung thư [15].
1.2.3.4. Hoạt tính chống đơng tụ máu và chống huyết khối
Nishino và cộng sự đã thử nghiệm hoạt tính chống đơng máu của fucoidan được phân lập từ 9 loài rong nâu. Trong số các fucoidan thử nghiệm, fucoidan từ E. kurome thể hiện hoạt tính cao nhất đối với APTT (activated
partial thromboplastin time) (38 đơn vị/mg) và TT (thromboplastin time) (35 đơn vị/mg), với fucoidan từ H. fusiforme hoạt tính APTT và TT tương ứng là 25 đơn vị/mg và 22 đơn vị/mg. Hoạt tính chống huyết khối của phân đoạn F4 của fucoidan từ L.angustata var. longissima là 200 đơn vị/mg, so với heparin (140 đơn vị/mg). Các nghiên cứu về hoạt tính chống đơng tụ máu của fucoidan từ một số loài rong (E. kurome, H. fusiforme, vv…) đã chỉ ra rằng hàm lượng sulfate có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính chống đơng tụ máu, hàm lượng sulfate càng cao thì hoạt tính chống đơng tụ càng lớn. Fucoidan sulfate hóa tồn phần bằng biến đổi hóa học fucoidan tự nhiên cũng làm tăng hoạt tính này [33].
1.2.3.5. Chống lại các bệnh về gan
Fucoidan tìm thấy trong rong nâu làm tăng đáng kể việc sản xuất một chất được gọi IT-IGF hoặc HGF. Các nhà nghiên cứu công nghệ sinh học ở Nhật, đã nghiên cứu cấu tạo xơ của một vài loại rong, trong khi tiến hành các nghiên cứu này họ đã phát hiện ra rằng fucoidan tìm thấy trong nhiều lồi rong nâu có thể làm tăng đáng kể việc sản xuất HGF. HGF là một cytokin rất đặc biệt, nó khơng chỉ kích thích việc tái tạo các tế bào gan mà đồng thời còn tăng cường việc sản xuất các tế bào da, tế bào cơ tim, sụn. Các nghiên cứu cho thấy HGF thực hiện một tổ hợp rộng các chức năng sinh hóa và được coi là quan trọng để tạo thành sẹo và phục hồi các mơ cơ thể. Chúng ta cịn biết rằng HGF là một protein làm chậm q trình lão hóa. Một số nghiên cứu tiền lâm sàng được tiến hành sau 1992 đã phát hiện ra rằng HGF có thể ngăn chặn viêm gan, điều trị xơ gan, liệt gan, xơ hóa phổi và làm chậm q trình già hóa.
Việc khám phá ra các hợp chất fucoidan có thể tăng cường việc sản xuất HGF, không chỉ chứa một niềm hy vọng lớn đối với những người bị đau do các bệnh gan, mà còn cho niềm hy vọng đối với tất cả những ai chịu đựng các bệnh suy thối, bao gồm suy yếu mơ xuất hiện khi có tuổi [37].
1.2.3.6. Giảm lipid máu
Số liệu từ phịng thí nghiệm cho thấy rằng, những con chuột ăn rong nâu có mức mỡ máu thấp hơn đáng kể so với những con không ăn rong. Sau 21 ngày thử rong biển các nhà khoa học đã kết luận rằng các hợp chất rong nâu làm thay đổi hoạt tính của các enzyme trong gan, kiểm sốt cách các axit béo được chuyển hóa, dẫn đến mức cholesterol thấp hơn. Các nhà nghiên cứu của Nhật Bản đã tiến hành một nghiên cứu mà trong đó các đối tượng kiểm tra được cho ăn 5g rong biển (có chứa fucoidan)/ngày trong 3 tuần. Kết quả, huyết áp và mức cholesterol cao của họ được cải thiện đáng kể. Kết quả đó đã được WHO cơng bố và họ khẳng định rằng thành phần fucoidan của một số thực vật biển xúc tiến việc đốt chất béo trong gan - một tác động hỗ trợ và bảo vệ hệ tim mạch. Fucoidan đồng thời cịn tối ưu hóa các mức của men HGF trong gan mà ở đó cholesterol được tạo ra và các axit béo được tổng hợp. Hơn nữa, rõ ràng là fucoidan có thể ngăn chặn sự tạo thành các cục máu đông, làm
giảm rủi ro do các cơn đau tim và đột qụy. Hoạt tính này đã được khảo sát trên người và đã được FDA của Mỹ cấp chứng nhận [38].
1.2.4. Ứng dụng của fucoidan
Trong suốt những thập niên vừa qua có rất nhiều những nghiên cứu đã đưa ra số lượng lớn bằng chứng khoa học về những lợi ích sức khỏe của fucoidan, một hợp chất sulfated polysaccharide hóa giàu fucose từ rong nâu. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học của fucoidan chiết xuất từ rong nâu đã mở ra những cơ hội tiềm năng cho ngành công nghiệp dược phẩm, thực phẩm dinh dưỡng, mỹ phẩm và thực phẩm chức năng. Hiện nay, trên thị trường đã xuất hiện nhiều loại fucoidan với thành phần, tác dụng và nhãn mác khác nhau như: LCR fucoidan của Larson Century Ranch, INC, Mỹ có tác dụng điều trị các bệnh ung thư vú, ruột kết, buồng trứng, cũng như tác dụng chống dị ứng, chống lão hóa, chống đái tháo đường, giảm cholesterol, loét dạ dày,…
Fucoidan Tongan Limu Moui của công ty AHD International, LLC, Mỹ có tác dụng trị tim mạch, chống lão hóa, tăng cường miễn dịch,… U-Fucoidan sản phẩm của tập đoàn Pharmaceutical Grade Nutritional Dietary Anti-aging Supplements, Mỹ gây ra sự giáng hóa các tế bào ung thư,… Fucoidan của tập đoàn Qingdao Yijia Huayi Import Export Co.,Ltd., Trung Quốc được sử dụng để phục hồi khả năng kháng ung thư, sản phẩm thuốc kháng virut, điều trị ung thư và tim mạch,. Sản phẩm Best fucoidan 70% của công ty Doctor best INC., Mỹ có tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư, ngăn ngừa lão hóa, tăng cường hệ miễn dịch.
Ở nước ta hiện nay, các sản phẩm fucoidan từ rong nâu Việt Nam đã xuất hiện trên thị trường dưới dạng thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị bệnh ung thư và viêm loét dạ dày do Công ty Cổ phần Fucoidan Việt Nam sản xuất là: FucoUmi, FucoAntiK và Fucogastro. Ngoài ra, fucoidan cũng được sử dụng như một thành phần chức năng trong sản phẩm sữa chua fucoidan và nước yến fucoidan của Cơng ty Sannet Khánh Hịa. Như vậy có thể thấy, fucoidan với rất nhiều hoạt tính sinh học thú vị cũng như tiềm năng ứng dụng hết sức rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của cuộc sống đang ngày càng thu hút sự quan tâm nghiên cứu mạnh mẽ của các nhà khoa học trên toàn thế giới [19][20].
1.3. TỔNG QUAN MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT FUCOIDAN
1.3.1. Phương pháp chiết fucoidan trong axit pH 2-3
Mẫu rong đã xay được trộn với HCl 0,1N ở pH 2-2,5 theo tỷ lệ 1:10 và được giữ ở 70 °C, tiến hành khuấy liên tục bằng máy khuấy từ trong 1 giờ. Quá trình này được lặp lại ba lần và mỗi lần, dịch lọc được thu thập, gom lại và đuổi bớt dung môi bằng cách cho bay hơi nước. Tiến hành tủa fucoidan bằng cách thêm ethanol 80%. Fucoidan được tinh chế thêm bằng cách thêm fomanđehit, sau đó được làm khơ và mang đi phân tích thành phần [16][19].
1.3.2. Phương pháp chiết fucoidan trong nước nóng
Các mẫu rong được xay nhỏ, lấy khoảng 10 gam ngâm dầm trong 300 ml nước nóng và giữ ở 100 °C trong 6 giờ. Sau đó, hỗn hợp được mang đi lọc và dịch lọc được tiến hành ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong vòng 10 phút. Thêm vào dịch lọc sau ly tâm một lượng tương đương ethanol 70% cho đến khi tạo kết tủa. Quá trình ly tâm sau đó được thực hiện một lần nữa để tách fucoidan rắn ra khỏi chất lỏng, cuối cùng thu được fucoidan kết tủa [39].
1.3.3. Phương pháp chiết fucoidan trong dung dịch CaCl2 2%
Năm 2018, Bilan và cộng sự đã thực hiện chiết thành công fucoidan từ rong nâu Alaria Marginata sinh trưởng tại vùng biển Thái Bình Dương bằng phương pháp chiết trong dung môi CaCl2 2%. Mẫu rong khơ 200g được xử lý ở nhiệt độ phịng với hỗn hợp MeOH-CHCl3-H2O tỉ lệ 4:2:1 để loại bỏ các chất màu, lọc rửa với axeton, sấy khô. Sau khi sấy khô bã rong được chiết với 250ml dung dịch CaCl2 2% (5 lần) mỗi lần dung dịch được khuấy trộn ở 85
oC trong 5 giờ. Dịch chiết 5 lần được gom lại, sau đó thêm 80ml dung dịch hexadecyltrimethylammoniumbromide nồng độ 10% trong nước. Tủa tạo thành được li tâm, rửa với nước nhiều lần, sau đó khuấy trộn với 150ml dung dịch NaI 20% trong cồn để ở nhiệt độ phòng trong vòng 2-3 ngày, ly tâm tách lấy phần tủa (làm như vậy 5 lần), sau đó rửa với cồn và hòa tan lại trong nước. Dung dịch được thẩm tách qua màng 10kDa và đông khô thu được fucoidan thô dưới dạng muối Na, hiệu suất chiết tính theo trọng lượng rong khô [40][20].
1.3.4. Phương pháp chiết fucoidan bằng ethanol
Trong phương pháp này, mẫu rong được xay nhỏ và được ngâm trong ethanol 95% theo tỷ lệ 1 : 2 và lắc đều trong 1 giờ để loại bỏ sắc tố, protein và lipid và sau đó được ly tâm trong 10 phút. Kết tủa thu được được pha với nước cất hai lần (w/v = 1:10) và đặt trong nồi cách thủy duy trì ở 40 oC trong 15 phút, lắc đều. Hỗn hợp sau đó được để lắng trong 10 phút và thu lấy phần nổi phía trên. Ethanol 95% được thêm vào phần nổi thu được ở trên để tạo ra ethanol 20%. Hỗn hợp tiếp tục để lắng một lần nữa trong 30 phút, tiếp tục thu lấy phần nổi phía trên. Ethanol 95% lại được thêm vào một lần nữa cho đến khi nồng độ ethanol cuối cùng là 50% là nồng độ ổn định để có thể thu được fucoidan. Fucoidan rắn thu được bằng cách sấy khô ở 40 oC [39].
1.3.5. Phương pháp chiết fucoidan bằng chất lỏng ion
Chất lỏng ion (ILs) được biết đến như là một loại muối nóng chảy ở nhiệt độ thường từ năm 1914 bởi Walden[41], chúng được hình thành bởi các cation và các anion có tính đối xứng và mật độ điện tích thấp[42] và thành phần cation và anion này tạo nên tính chất hóa lý riêng biệt của từng ILs như điểm nóng chảy, độ phân cực tính, độ nhớt, mức độ ổn định nhiệt và hóa học, tính chất solvation hóa[43] ... Các cấu trúc của ILs có thể dễ dàng bị biến đổi thông qua thay đổi các cation hoặc anion. Có vơ số các kiểu kết hợp khác nhau của cặp ion cation/anion khác nhau, điều này dẫn đến khả năng điều chỉnh các đặc tính của ILs như tính chất nhiệt vật lý, khả năng phân hủy sinh học, độc tính, tính kỵ nước…để đáp ứng nhu cầu ứng dụng. Chính vậy mà ILs mô tả như là một loại dung môi được thiết kế để đưa ra các giải pháp “designer solvents”[44]. Nhờ áp suất hơi bão hịa thấp, khơng bắt lửa, cửa sổ điện hóa rộng, ổn định nhiệt và hóa học cao, và có khả năng hịa tan một loạt các hợp chất hữu cơ và vô cơ mà ILs tỏ ra vượt trội so với các dung môi hữu cơ[45]. Sự thay thế dung môi hữu cơ dễ bay hơi bởi ILs không bay hơi giúp loại bỏ tổn thất dung mơi vào khí quyển, làm giảm ơ nhiễm mơi trường. Đây là lý do chính mà chất lỏng ion là được coi là dung mơi xanh. Với những tính chất ưu việt của mình , ILs được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực như hóa lý, hóa phân tích, hóa hữu cơ... ILs được hi vọng là sẽ tạo ra một hướng mới
trong hóa học khi hướng đến hóa học xanh thân thiện với môi trường.
Nhiều hợp chất trong rong biển có ích và có giá trị kinh tế cao như sufate polysaccharide, lipid, các chất chuyển hóa thứ cấp, nhóm các hợp chất làm nguyên liệu và nhiên liệu hóa học... Tuy nhiên khả năng hịa tan không tốt trong dung môi thông thường đã hạn chế khả năng sử dụng hiệu quả chúng. Trong thập kỷ trở lại đây đã có cơng trình nghiên cứu mà ILs đã được sử dụng làm dung môi chiết để thu hồi các hóa chất có giá trị từ vi tảo biển. Teixeira RE[46] đã nghiên cứu sử dụng 03 loại ILs để chiết lipid từ loài vi tảo Chlorella vulgaris là ([Bmim][BF4],[Bmim] Cl và[Amim] Cl). Kết quả là cả 03 lồi Ils sử dụng đều có khả năng chiết xuất lipid một cách hiệu quả và việc bổ sung CO2 vào[Bmim][BF4] trong q trình chiết có thể làm tăng hiệu suất chiết lipid từ 14,2% lên 15,6%. Cùng đối tượng loài vi tảo này, các nhà khoa học Hàn Quốc đã nghiên cứu quy trình chiết lipid từ sinh khối tảo bằng hỗn hợp[Bmim][CF3SO3] và methanol [47]. Tổng hàm lượng lipid được chiết xuất từ Chlorella Vulgaris thương mại và nuôi cấy theo phương pháp Bligh và Dyer thông thường lần lượt là 10,6% và 11,1%, trong khi sử dụng hỗn hợp[Bmim][CF3SO3] và methanol hiệu suất lipid tăng lên 12,5% và 19,0% , tương ứng. Đặc biệt là nghiên cứu của một số nhóm tác giả Nhật Bản vào