Đỉnh Dao động
775 Dao động dãn vòng của α- anome
802-810 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí C6
822 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí equatorial 845 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí axial 847 Dao động của liên kết C1-H của α- anome
893 Dao động của liên kết C1-H của β- anomer 917 Dao động vòng của α-anome
1030-1167 Dao động hoá trị của hemiacetal
1034 Dao động hoá trị đối xứng của C-O-C 1255-1264 Dao động hoá trị của S=O
1420 Dao động hoá trị đối xứng của C-O-O 1430 Dao dộng gấp của C-H
1730 Dao động hoá trị của C=O 3300-3440 Dao động hoá trị của O-H
2.2.2.8. Phương pháp điện di trên gel carbonhydrate-polyacrilamide
Điện di trên gel carbonhydrate-polyacrilamide (C-PAGE) là một phương pháp được sử dụng để mô tả polysaccharide thành tế bào thực vật như hemicellulose, pectins và các sản phẩm thủy phân của carrageenan, fucoidan. Trong luận văn này, chúng tôi nghiên cứu thêm việc sử dụng C-PAGE để khảo sát sự khác nhau về khối lượng phân tử của Fucoidan được thu nhận từ các phương pháp chiết khác nhau, qua đó có thêm cơ sở để nhận xét sự ảnh hưởng của phương pháp chiết đến hiệu suất thu nhận fucoidan do việc kết tủa trong tỉ lệ 1:4 thể tích cồn 96% của fucoidan phụ thuộc nhiều vào khối lượng
phân tử của chúng, khối lượng phân tử lớn thì khả năng kết tủa trong cồn của fucoidan càng hiệu quả. Ngoài ra, hoạt tính sinh học của fucoidan cũng đã được chứng minh phụ thuộc vào khối lượng phân tử của chúng [5][6][7][8].
Quy trình phân tích C-PAGE được mô tả như sau. Các fucoidan thô được trộn với 10μL dung dịch đệm chứa 10% glyxerol trong nước và 0,02% phenol đỏ. Điện di các oligosaccharide đã sunfat hóa được thực hiện bằng cách sử dụng gel xếp chồng 5% (w / v) với đệm Tris-HCl 50 mM có pH=6,8 và 27% (w / v) phân giải gel polyacrylamide với đệm Tris-HCl 150 mM có pH=8,8. Nhuộm gel được thực hiện với dung dịch chứa 0,01% O-toluidine xanh lam trong etanol, axit axetic và nước với tỷ lệ thể tích 2:1:1 hoặc với xanh lam alcian và xanh lam toluidine. Quá trình nhuộm các oligomer fucoidan cũng được thực hiện bằng dung dịch nitrat xanh và bạc alcian. Các dải trên điện đồ tương ứng với các oligosaccharide tích điện âm[64].
2.2.3. Phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa của fucoidan
2.2.3.1. Phương pháp xác định hoạt tính oxy hóa tổng số
Khả năng chống oxy hóa tổng được xác định bằng phương pháp Prieto. Lấy 0,5 ml mẫu thêm 0,5 ml nước và 3 ml dung dịch phản ứng (0,6 Mol axit sunfuric, 28 mMol natrisulfate và 4 mMol amoni molydat) được đặt ở 95 oC trong 90 phút. Đo mật độ quang của hỗn hợp phản ứng ở bước sóng 695 nm. Dùng axit ascorbic làm chất chuẩn [65].
2.2.3.2. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa bằng DPPH.
Chuẩn bị hóa chất:
- Dung dịch DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl): Cân 25 mg pha trong 1000 ml ethanol tuyệt đối. Giữ trong bình tối.
- Axit ascorbic: Pha nồng độ 1 mg/ml trong nước. - Các mẫu chất: Pha nồng độ 1 mg/ml trong nước.
Tiến hành kiểm tra hoạt tính chống oxy hóa bằng DPPH: - Mẫu trắng: 1 ml nước cất + 3 ml ethanol tuyệt đối.
- Mẫu âm tính: 1 ml nước cất + 3 ml DPPH.
- Các mẫu kiểm tra: 0,5 ml mẫu chất + 0,5 ml nước cất + 3 ml DPPH. Tất cả các thí nghiệm được lắc đều và để yên trong bóng tối 30 phút, sau đó được đo độ hấp thu quang ở bước sóng 517 nm [66]. Khả năng khử gốc tự do DPPH (SC) được xác định theo công thức sau:
2.3. THỰC NGHIỆM
2.3.1. Thu thập và xử lý rong nâu Sargassum mcclurei
Mẫu rong S. mcclurei được thu thập ngay sau thời kì sinh sản vào tháng 6 năm 2020 tại khu vực Hòn Chồng, vịnh Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa. Khi thu, dùng liềm cắt sát gốc cây rong, rửa sạch tạp chất bằng nước biển và phơi khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Khối lượng mỗi mẫu thu tối tiểu là 10kg rong tươi. Các mẫu rong dạng tiêu bản ép khô được lưu trữ tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang.
2.3.2. Chiết fucoidan trong rong nâu Sargassum mcclurei
Trong luận văn này, tiến hành chiết fucoidan từ rong nâu S. mcclurei theo 05 phương pháp gồm:
Chiết fucoidan từ nước nóng theo phương pháp đã trình bày tại Tiểu mục 2.2.1.1.;
Chiết fucoidan bằng dung dịch axit HCl (pH=2-3) theo phương pháp đã trình bày tại Tiểu mục 2.2.1.2.;
Chiết fucoidan bằng dung dịch CaCl2 2% theo phương pháp đã trình bày tại Tiểu mục 2.2.1.3.;
Chiết fucoidan có sự hỗ trợ của enzyme theo phương pháp đã trình bày tại Tiểu mục 2.2.1.4.;
Chiết fucoidan bằng chất lỏng ion theo phương pháp đã trình bày tại
Tiểu mục 2.2.1.5.
2.3.3. Xác định thành phần hóa học của fucoidan
Tiến hành phân tích hàm lượng carbohydrate theo phương pháp đã trình bày tại tiểu mục 2.2.2.1.;
Tiến hành phân tích hàm lượng sulfate theo phương pháp đã trình bày tại
tiểu mục 2.2.2.3.;
Tiến hành phân tích hàm lượng uronic acid theo phương pháp đã trình bày tại tiểu mục 2.2.2.4.;
Tiến hành phân tích hàm lượng polyphenol theo phương pháp đã trình bày tại tiểu mục 2.2.2.5.;
Tiến hành phân tích hàm lượng protein theo phương pháp đã trình bày tại tiểu mục 2.2.2.6.;
Tiến hành phân tích thành phần đường đơn theo phương pháp đã trình bày tại tiểu mục 2.2.2.2.;
Tiến hành phân tích vị trí của nhóm sulfate trong fucoidan theo phương pháp đã trình bày tại tiểu mục 2.2.2.7.
2.3.4. Xác định hoạt tính chống oxy hóa của fucoidan
Tiến hành xác định hoạt tính oxy hóa tổng số của fucoidan theo phương pháp đã trình bày tại tiểu mục 2.2.3.1.;
Tiến hành thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa bằng DPPH theo phương pháp đã trình bày tại tiểu mục 2.2.3.2.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN
Trong luận văn này, chúng tôi phân tích các chỉ tiêu carbohydrate tổng số, hàm lượng sulfate, hàm lượng uronic acid, hàm lượng polyphenol, hàm lượng protein, hàm lượng hoạt tính chống oxy hóa tổng số, thành phần đường đơn bằng các phương pháp truyền thống như trắc quang và phương pháp hiện đại như HPLC... Để phân tích định lượng các chỉ tiêu trên, chúng tôi tiến hành xây dựng đường chuẩn để xác định khoảng tuyến tính và độ tin cậy. Kết quả dẫn ra trên các phụ lục 1, 5, 6, 7, 8.
Kết quả phân tích cho thấy tất cả các giá trị R2 của các phương trình đường chuẩn đều có giá trị ~ 1,0 chứng tỏ các phương trình tuyến tính có độ tin cậy cao. Chúng tôi xác định hàm lượng các chất thông qua phương trình đường chuẩn và khoảng tuyến tính của nồng độ tương ứng.
3.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN RONG NGUYÊN LIỆU
Để định hướng các phương pháp chiết, đầu tiên, các thành phần hóa học của rong nguyên liệu S. mcclurei được xác định. Kết quả phân tích các thành phần hóa học của rong nguyên liệu bao gồm: Tro; Độ ẩm; Protein tổng số; Carbohydate tổng số; Fucoidan; Alginate; Polyphenol tổng số và Hàm lượng sulfate tổng số thể hiện ở Bảng 3.1.