Đỉnh Dao động
775 Dao động dãn vòng của α- anome
802-810 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí C6
822 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí equatorial 845 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí axial 847 Dao động của liên kết C1-H của α- anome
893 Dao động của liên kết C1-H của β- anomer 917 Dao động vòng của α-anome
1030-1167 Dao động hoá trị của hemiacetal
1034 Dao động hoá trị đối xứng của C-O-C 1255-1264 Dao động hoá trị của S=O
1420 Dao động hoá trị đối xứng của C-O-O 1430 Dao dộng gấp của C-H
1730 Dao động hoá trị của C=O 3300-3440 Dao động hoá trị của O-H
2.2.2.8. Phương pháp điện di trên gel carbonhydrate-polyacrilamide
Điện di trên gel carbonhydrate-polyacrilamide (C-PAGE) là một phương pháp được sử dụng để mô tả polysaccharide thành tế bào thực vật như hemicellulose, pectins và các sản phẩm thủy phân của carrageenan, fucoidan. Trong luận văn này, chúng tôi nghiên cứu thêm việc sử dụng C-PAGE để khảo sát sự khác nhau về khối lượng phân tử của Fucoidan được thu nhận từ các phương pháp chiết khác nhau, qua đó có thêm cơ sở để nhận xét sự ảnh hưởng của phương pháp chiết đến hiệu suất thu nhận fucoidan do việc kết tủa trong tỉ lệ 1:4 thể tích cồn 96% của fucoidan phụ thuộc nhiều vào khối lượng
phân tử của chúng, khối lượng phân tử lớn thì khả năng kết tủa trong cồn của fucoidan càng hiệu quả. Ngồi ra, hoạt tính sinh học của fucoidan cũng đã được chứng minh phụ thuộc vào khối lượng phân tử của chúng [5][6][7][8].
Quy trình phân tích C-PAGE được mơ tả như sau. Các fucoidan thô được trộn với 10μL dung dịch đệm chứa 10% glyxerol trong nước và 0,02% phenol đỏ. Điện di các oligosaccharide đã sunfat hóa được thực hiện bằng cách sử dụng gel xếp chồng 5% (w / v) với đệm Tris-HCl 50 mM có pH=6,8 và 27% (w / v) phân giải gel polyacrylamide với đệm Tris-HCl 150 mM có pH=8,8. Nhuộm gel được thực hiện với dung dịch chứa 0,01% O-toluidine xanh lam trong etanol, axit axetic và nước với tỷ lệ thể tích 2:1:1 hoặc với xanh lam alcian và xanh lam toluidine. Quá trình nhuộm các oligomer fucoidan cũng được thực hiện bằng dung dịch nitrat xanh và bạc alcian. Các dải trên điện đồ tương ứng với các oligosaccharide tích điện âm[64].
2.2.3. Phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa của fucoidan
2.2.3.1. Phương pháp xác định hoạt tính oxy hóa tổng số
Khả năng chống oxy hóa tổng được xác định bằng phương pháp Prieto. Lấy 0,5 ml mẫu thêm 0,5 ml nước và 3 ml dung dịch phản ứng (0,6 Mol axit sunfuric, 28 mMol natrisulfate và 4 mMol amoni molydat) được đặt ở 95 oC trong 90 phút. Đo mật độ quang của hỗn hợp phản ứng ở bước sóng 695 nm. Dùng axit ascorbic làm chất chuẩn [65].
2.2.3.2. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa bằng DPPH.
Chuẩn bị hóa chất:
- Dung dịch DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl): Cân 25 mg pha trong 1000 ml ethanol tuyệt đối. Giữ trong bình tối.
- Axit ascorbic: Pha nồng độ 1 mg/ml trong nước. - Các mẫu chất: Pha nồng độ 1 mg/ml trong nước.
Tiến hành kiểm tra hoạt tính chống oxy hóa bằng DPPH: - Mẫu trắng: 1 ml nước cất + 3 ml ethanol tuyệt đối.
- Mẫu âm tính: 1 ml nước cất + 3 ml DPPH.
- Các mẫu kiểm tra: 0,5 ml mẫu chất + 0,5 ml nước cất + 3 ml DPPH. Tất cả các thí nghiệm được lắc đều và để n trong bóng tối 30 phút, sau đó được đo độ hấp thu quang ở bước sóng 517 nm [66]. Khả năng khử gốc tự do DPPH (SC) được xác định theo công thức sau:
2.3. THỰC NGHIỆM
2.3.1. Thu thập và xử lý rong nâu Sargassum mcclurei
Mẫu rong S. mcclurei được thu thập ngay sau thời kì sinh sản vào tháng 6 năm 2020 tại khu vực Hòn Chồng, vịnh Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa. Khi thu, dùng liềm cắt sát gốc cây rong, rửa sạch tạp chất bằng nước biển và phơi khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Khối lượng mỗi mẫu thu tối tiểu là 10kg rong tươi. Các mẫu rong dạng tiêu bản ép khô được lưu trữ tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang.
2.3.2. Chiết fucoidan trong rong nâu Sargassum mcclurei
Trong luận văn này, tiến hành chiết fucoidan từ rong nâu S. mcclurei theo 05 phương pháp gồm:
Chiết fucoidan từ nước nóng theo phương pháp đã trình bày tại Tiểu mục 2.2.1.1.;
Chiết fucoidan bằng dung dịch axit HCl (pH=2-3) theo phương pháp đã trình bày tại Tiểu mục 2.2.1.2.;
Chiết fucoidan bằng dung dịch CaCl2 2% theo phương pháp đã trình bày tại Tiểu mục 2.2.1.3.;
Chiết fucoidan có sự hỗ trợ của enzyme theo phương pháp đã trình bày tại Tiểu mục 2.2.1.4.;
Chiết fucoidan bằng chất lỏng ion theo phương pháp đã trình bày tại
Tiểu mục 2.2.1.5.
2.3.3. Xác định thành phần hóa học của fucoidan
Tiến hành phân tích hàm lượng carbohydrate theo phương pháp đã trình bày tại tiểu mục 2.2.2.1.;
Tiến hành phân tích hàm lượng sulfate theo phương pháp đã trình bày tại
tiểu mục 2.2.2.3.;
Tiến hành phân tích hàm lượng uronic acid theo phương pháp đã trình bày tại tiểu mục 2.2.2.4.;
Tiến hành phân tích hàm lượng polyphenol theo phương pháp đã trình bày tại tiểu mục 2.2.2.5.;
Tiến hành phân tích hàm lượng protein theo phương pháp đã trình bày tại tiểu mục 2.2.2.6.;
Tiến hành phân tích thành phần đường đơn theo phương pháp đã trình bày tại tiểu mục 2.2.2.2.;
Tiến hành phân tích vị trí của nhóm sulfate trong fucoidan theo phương pháp đã trình bày tại tiểu mục 2.2.2.7.
2.3.4. Xác định hoạt tính chống oxy hóa của fucoidan
Tiến hành xác định hoạt tính oxy hóa tổng số của fucoidan theo phương pháp đã trình bày tại tiểu mục 2.2.3.1.;
Tiến hành thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa bằng DPPH theo phương pháp đã trình bày tại tiểu mục 2.2.3.2.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN
Trong luận văn này, chúng tơi phân tích các chỉ tiêu carbohydrate tổng số, hàm lượng sulfate, hàm lượng uronic acid, hàm lượng polyphenol, hàm lượng protein, hàm lượng hoạt tính chống oxy hóa tổng số, thành phần đường đơn bằng các phương pháp truyền thống như trắc quang và phương pháp hiện đại như HPLC... Để phân tích định lượng các chỉ tiêu trên, chúng tôi tiến hành xây dựng đường chuẩn để xác định khoảng tuyến tính và độ tin cậy. Kết quả dẫn ra trên các phụ lục 1, 5, 6, 7, 8.
Kết quả phân tích cho thấy tất cả các giá trị R2 của các phương trình đường chuẩn đều có giá trị ~ 1,0 chứng tỏ các phương trình tuyến tính có độ tin cậy cao. Chúng tôi xác định hàm lượng các chất thơng qua phương trình đường chuẩn và khoảng tuyến tính của nồng độ tương ứng.
3.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN RONG NGUYÊN LIỆU
Để định hướng các phương pháp chiết, đầu tiên, các thành phần hóa học của rong nguyên liệu S. mcclurei được xác định. Kết quả phân tích các
thành phần hóa học của rong nguyên liệu bao gồm: Tro; Độ ẩm; Protein tổng số; Carbohydate tổng số; Fucoidan; Alginate; Polyphenol tổng số và Hàm lượng sulfate tổng số thể hiện ở Bảng 3.1.
Bảng 3. 1. Kết quả phân tích thành phần hóa học của rong ngun liệu S T T Chỉ tiêu phân tích Đơn vị tính
Kết quả phân tích Giá trị trung bình M1 M2 M3 1 Tro % 37,8 36,8 38,8 37,8 ± 1,0 2 Độ ẩm % 19,4 18,3 20,2 19,3 ± 1,0 3 Protein tổng số % 5,5 5,8 5,9 5,7 ± 0,2 4 Carbohydate tổng số % 35,0 34,5 36,4 35,3 ± 1,0 5 Alginate % 29,9 30,8 32,7 31,1 ± 1,4 6 Polyphenol tổng số % 0,2 0,2 0,2 0,2 ± 0,0
7 Fucoidan % 3,2 3,3 3,6 3,4 ± 0,2
8 Hàm lượng sulfate tổng số % 4,5 4,3 4,7 4,5 ± 0,2
9 Hàm lượng cellulose tổng số % 5,1 5,2 5,4 5,2 ± 0,2 Kết quả tại Bảng 3.1 cho thấy, các thành phần cơ bản trong thành tế bào rong nâu đều hiện diện trong thành phần của rong S. mcclurei. Trong đó, hàm lượng fucoidan khi chiết bằng phương pháp hóa học chiếm 3,4%; alginate chiếm 31,1% và polyphenol tổng số chiếm 0,2%. Để có thể thích nghi với điều kiện sống ở vùng biển nhiệt đới, các thành phần như alginate, fucoidan và polyphenol liên kết chặt chẽ với nhau, liên kết với cellulose để tạo cấu trúc thành tế bào vững chắc [67] (Hình 3.1.).
Hình 3. 1. Mơ hình cấu trúc thành tế bào của rong nâu [67]
Trong các thành phần rong nâu thì fucoidan liên kết chặt chẽ với mạng lưới cellulose và hemicellulose, liên kết với protein và cả với polyphenol thông qua các liên kết hóa học chặt chẽ. Do đó, muốn chiết xuất hiệu quả fucoidan cần có những phương pháp chiết thích hợp. Nguyên tắc của sự chiết xuất là sự thẩm thấu của fucoidan qua thành tế bào vào môi trường chiết (phương pháp chiết axit, nước và CaCl2), bên cạnh đó khi sử dụng enzyme hoặc dùng chất lỏng ion có thể phá vỡ các liên kết của của fucoidan với thành phần khác của thành tế bào như cellulose và hemicellulose có thể dẫn đến nâng cao hiệu suất chiết fucoidan, đồng thời với điều kiện chiết nhẹ nhàng có thể bảo tồn được cấu trúc của fucoidan. Do đó, trong đề tài này, 5 phương
pháp chiết được sử dụng đó là: Chiết bằng nước nóng; Chiết bằng axit HCl (pH=2-3); Chiết bằng dung dịch CaCl2 2%; Chiết có hỗ trợ enzyme và Chiết bằng chất lỏng ion được thực hiện với các nguyên tắc sau:
- Chiết bằng nước nóng: Dựa vào sự thẩm thấu của fucoidan trong môi trường nước, nhiệt độ càng cao thì khả năng hịa tan cao.
- Chiết bằng dung dịch CaCl2 2%: Ion Ca2+ đã kết tủa với các muối alginate hóa trị (I) ở trong tế bào rong nâu về dạng muối canxi alginate khơng tan, do đó thành phần alginate được cố định trên bã rong và thuận lợi trong quá trình loại bỏ bằng cách lọc.
- Chiết bằng HCl (pH 2-3): Trong môi trường axit, các muối alginate chuyển về dạng axit alginic khơng tan, do đó thành phần alginate được cố định trên bã rong và thuận lợi trong quá trình loại bỏ bằng cách lọc.
- Chiết có hỗ trợ enzyme: Sử dụng Viscozyme với thành phần gồm cellulase và hemicellulase để phá vỡ thành cellulsose, giải phóng fucoidan vào môi trường chiết.
- Chiết bằng chất lỏng ion: Chất lỏng ion có thể hịa tan một lượng lớn carbohydrate từ sinh khối của rong nâu, nhiệt độ càng tăng thì khả năng hịa tan càng mạnh, phá vỡ thành cellulsose, giải phóng fucoidan vào mơi trường chiết.
3.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH HIỆU SUẤT CHIẾT FUCOIDAN TỪ RONG
SARGASSUM MCCLUREI BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP KHÁC NHAU
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành chiết fucoidan bằng các phương pháp chiết gồm: chiết bằng nước nóng, chiết bằng dung dịch axit HCl (pH=2-3), chiết bằng dung dịch CaCl2 2%, chiết có sự hỗ trợ của enzyme và chiết bằng chất lỏng ion từ loài rong nâu S. mcclurei được thu nhận vào cùng một thời điểm, cùng một địa điểm (khu vực biển Hòn Chồng, Vịnh Nha Trang vào tháng 06/2020), nhằm đánh giá mức độ ảnh hưởng của phương pháp chiết đến hiệu suất thu nhận fucoidan. Kết quả dẫn ra trên Bảng 3.2.
Bảng 3. 2. Hiệu suất thu nhận fucoidan từ các phương pháp chiết khác nhau Các kết quả Các kết quả thu nhận Phương pháp chiết Chiết bằng nước nóng Chiết bằng HCl (pH=2-3) Chiết bằng CaCl2 2% Chiết có hỗ trợ enzyme Chiết bằng chất lỏng ion Khối lượng rong
khô đã chiết (g) 50 50 50 50 50
Hiệu suất thu nhận fucoidan (% khối lượng của rong khô)
3,8 ± 0,5 3,4 ± 0,2 2,8 ± 0,2 13,4 ± 0,4 13,1 ± 0,5
Kết quả thực nghiệm tại Bảng 3.2 cho thấy hiệu suất chiết fucoidan từ rong nâu S. mcclurei thu nhận tại cùng 1 địa điểm, cùng 1 thời điểm đối với những phương pháp chiết khác nhau là khác nhau, dao động từ 2,8 ± 0,2 % (đối với chiết bằng CaCl2 2%) đến 13,4 ± 0,4 % (đối với chiết có hỗ trợ enzyme). Trong đó, hiệu suất chiết của 2 phương pháp có hỗ trợ enzyme và sử dụng chất lỏng ion là gần như nhau với các giá trị 13,4 % và 13,1 % và hiệu suất này cao gấp 3,5 đến 4,7 lần so với các phương pháp chiết còn lại là pháp chiết bằng dung mơi trung tính (nước nóng), chiết bằng dung mơi axit, chiết bằng dung dịch CaCl2 2%.
Khi sử dụng phương pháp chiết với sự hỗ trợ của enzyme, hiệu suất thu nhận là lớn nhất đạt 13,4 %. Điều này có thể được giải thích đó là do sự hoạt động của enzyme cellulase và hemicellulase đã phá vỡ cấu trúc bền vững của thành thế bào rong nâu, giải phóng fucoidan vào trong mơi trường chiết. Bên cạnh đó, với điều kiện chiết của enzyme, fucoidan không bị phá vỡ cấu trúc thành những mono hoặc oligosaccharide không thể kết tủa được bằng cồn nên hiệu suất thu nhận được cao. Điều này được chứng minh bằng việc so sánh khối lượng phân tử của fucoidan bằng phương pháp C-PAGE (Hình 3.2)
1 2 3 4 5
Hình 3. 2. Hình điện di C-PAGE của fucoidan chiết bằng các phương pháp
chiết khác nhau: (1) Chiết bằng HCl; (2) Chiết có hỗ trợ enzyme; (3) chiết bằng CaCl2; (4) Chiết bằng chất lỏng ion; (5) Chiết bằng nước nóng.
Theo kết quả phân tích tại Bảng 3.1. (Kết quả phân tích thành phần hóa học của rong nguyên liệu) thì hàm lượng carbohydrate chiếm đến 35,3% bao gồm fucoidan, laminaran, cellulose, hemicelulose và lượng nhỏ tinh bột (α-1,4- glucan) khoảng 1-4,0 %. Trong đó, cellulose tan trong chất lỏng ion dạng[Bmim][Cl] do hình thành liên kết hydro giữa OH-cellulose và chất lỏng ion (Ils) theo cơ chế cho nhận Hình 2.6, kết quả là thành tế bào rong nâu hoàn toàn bị phá vỡ kéo theo phần lớn các chất chứa trong chúng được hòa tan trong chất lỏng ion. Sau đó, chiết fucoidan ra khỏi chất lỏng ion và tủa bằng cồn.
Như vậy, chiết với hỗ trợ enzyme và chiết bằng chất lỏng ion đều tác động đến thành tế bào rong nâu thông qua sự phá vỡ liên kết của cellulose, hemicelulose và hòa tan cellulose. Kết quả này dẫn theo các chất tan trong dung dịch chiết sẽ được kéo ra khỏi thành tế bào rong, chính vì vậy mà hiệu suất chiết fucoidan bằng 02 phương pháp nói trên là cao nhất và có giá trị gần như nhau. Trong khi đó, chiết fucoidan bằng 03 phương pháp cịn lại là chiết bằng nước nóng, dung dịch HCl pH=2 và chiết bằng dung dịch CaCl2 2% đều dựa trên khả năng fucoidan và một số hợp chất khác được thẩm thấu qua thành tế bào rong
nâu và hịa tan trong dung mơi chiết, vì vậy hiệu suất chiết fucoidan của cả 03 phương pháp này đều khác biệt hoàn toàn so với hiệu suất của 02 phương pháp có khả năng phá vỡ và hòa tan thành tế bào rong nâu.
Bên cạnh đó, sự khác nhau về hiệu suất chiết fucoidan bằng các dung mơi khác nhau cịn có thể được giải thích là do các dung mơi khác nhau sẽ có độ phân cực, moment lưỡng cực và liên kết hiđro khác nhau..., từ đó chúng sẽ có sự tác động khác nhau để phá vỡ các liên kết không bền của fucoidan trong thành tế bào rong nâu và thu được fucoidan trong dung dịch chiết, chính sự tác động khác nhau này của các phương pháp chiết đã làm cho ở cùng 1 loài rong rong nâu S. mcclurei thu nhận tại cùng 1 địa điểm, cùng 1 thời gian mà hiệu suất chiết fucoidan thu nhận được có sự khác nhau. Cụ thể, khi tiến hành chiết fucoidan với dung dịch CaCl2 2% và dung môi axit, ion Ca2+ và H+ đã xảy ra phản ứng trao đổi với các muối alginate hóa trị (I) ở trong tế bào rong nâu để đưa về dạng kết tủa của muối canxi alginate và axit alginic do đó thành phần alginate được cố định trên bã rong và thuận lợi trong quá trình loại bỏ bằng cách lọc. Tuy nhiên, cũng chính những kết tủa này vơ hình trung đã bó chặt các phân tử fucoidan trên thành tế bào của rong nâu, làm cho hiệu suất chiết fucoidan của phương pháp chiết bằng 2 dung môi này giảm đi rõ rệt so với chiết sử dụng dung mơi nước. Ngồi ra, CaCl2 còn liên kết với các hợp chất polyphenol hình thành phức khơng tan và cố định trên bã rong, do đó sản phẩm fucoidan thô thu nhận được khi chiết bằng phương pháp này cũng tinh