2.2.2. Phương pháp xác định thành phần hóa học của fucoidan
2.2.2.1. Phương pháp phân tích hàm lượng tổng carbohydrate
Hàm lượng tổng carbohydrate được xác định bằng phương pháp phenol-axit sulfuric. Chuẩn bị dung dịch mẫu có nồng độ carbohydrate thích hợp, lấy 200µl dung dịch mẫu thêm vào 200µl thuốc thử phenol 5% lắc đều đến khi dung dịch trở nên trong suốt thêm tiếp 1ml axit sulfuric đậm đặc lắc đều rồi đem đun cách thủy trong thời gian 5 phút lấy ra để nguội, đo độ hấp thụ quang ở bước sóng λ = 490 nm. Dung dịch chuẩn sử dụng glucose hoặc
Dịch chiết rong
Fucoidan thô Rong đã loại chất béo
Rong khô
Polyphenol, chất màu, các hợp chất có trọng lượng phân tử thấp
galactose [57].
2.2.2.2. Phương pháp phân tích thành phần đường đơn
Thành phần đường đơn được xác định bằng phương pháp HPLC sau khi fucoidan được thủy phân axit về các monomer và tiến hành xây dựng đường chuẩn dựa trên diện tích pic tương ứng. Mẫu fucoidan (5 mg) cho vào ống nghiệm có nút vặn, thêm 1ml TFA (Triflorua acetic acid) 2M, thủy phân trong 6 giờ ở 100 oC sau đó cho bay hơi đến gần khô bằng máy cô quay chân không, rửa lặp lại 3 lần với MeOH để đuổi hết TFA dư. Phần cặn còn lại hòa tan với 1 ml nước đề ion, dung dịch này được dùng để phân tích thành phần đường trên thiết bị phân tích hydrat cacbon IC-500 Biotronik (Germany), sử dụng cột Shim-pack ISA- 07/S2504 (0.4 x 25 cm), pha động là đệm borat kali, tốc độ rửa giải 0.6 ml/phút. Đường đơn được phát hiện bằng phương pháp bicinchorinate trên hệ phân tích Shimadzu C- R2 AX. [58].
2.2.2.3. Phương pháp phân tích hàm lượng sulfate
Hàm lượng sulfate được xác định bằng phương pháp đo độ đục với BaCl2/gelatin. Cân khoảng 5 mg mẫu fucoidan trong một lọ thủy tinh có nút vặn, dung tích 5ml, thêm 2 ml HCl 1N, đem thủy phân ở nhiệt độ 100oC, thời gian 6 giờ. Lấy 10 µl dung dịch mẫu sau thủy phân, thêm vào 100 µl TCA (Triclorua acetic acid) và 100µl hỗn hợp (0,5% gelatin và 0,5% BaCl2), lắc đều và đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 360 nm [59].
2.2.2.4. Phương pháp phân tích hàm lượng uronic acid
Hàm lượng uronic acid được xác định theo phương pháp Carbazol. Lấy 250 μl dung dịch mẫu fucoidan và mẫu so sánh (mẫu carbohydrate không chứa uronic acid) cho vào ống nghiệm, thêm vào 1,5 ml dung dịch A (0,9g NaBH4 trong 10ml nước cất, thêm 90ml H2SO4 và để lạnh qua đêm), phản ứng được tiến hành ở 100 oC trong thời gian 10 phút. Làm lạnh nhanh phản ứng trong cốc nước đá, thêm tiếp 50 μl dung dịch B (100mg carbazole trong 100ml ethanol 96%) lắc đều và cho phản ứng lại ở 100 oC trong 15 phút, làm lạnh nhanh phản ứng đến nhiệt độ phòng và tiến hành đo mật độ quang ở bước sóng λ = 525 nm. Dùng D-glucuronic acid làm chất chuẩn [60].
2.2.2.5. Phương pháp phân tích hàm lượng polyphenol
Hàm lượng polyphenol được xác định theo phương pháp Folin Ciocalteu. Lấy 0,5 ml mẫu thêm 0,5 ml nước, tiếp theo cho vào mẫu 1 ml thuốc thử Folin Ciocalteu và 2 ml Na2CO3 10%. Hỗn hợp ủ trong tối 30 phút. Đo mật độ quang hỗn hợp phản ứng ở bước sóng 750 nm. Dùng Phloroglucinol làm chất chuẩn [61].
2.2.2.6. Phương pháp phân tích hàm lượng protein
Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Lowry. Chuẩn bị hóa chất làm thuốc thử:
- Dung dịch A: Na2CO3 2% trong NaOH 0,1N - Dung dịch B: NaK Tartrate 1% trong nước cất - Dung dịch C: CuSO4.5H2O 0,5% trong nước cất
Lấy 0,5 ml dung dịch mẫu chứa protein với hàm lượng thích hợp, thêm vào đó 2 ml dung dịch D (48ddA:1ddB:1ddC), lắc đều để yên trong 10 phút, sau đó thêm vào hỗn hợp 0,25 ml Folin đã pha loãng 2 lần, lắc đều và để yên trong 30 phút, màu vàng của hỗn hợp chuyển sang màu xanh da trời và đạt đến cường độ cực đại. Đo mật độ quang hỗn hợp phản ứng ở bước sóng 750 nm. Dùng Anbumin huyết thanh bò (BSA) làm chất chuẩn [62].
2.2.2.7. Phương pháp phân tích vị trí của nhóm sulfate trong fucoidan
Vị trí nhóm sulfate được xác định bằng phương pháp phổ IR.
Dựa vào vùng phổ hấp thụ đặc trưng của nhóm sulfate trong phổ hồng ngoại mà ta có thể xác định được vị trí liên kết của nhóm sulfate trong các gốc đường ở vị trí axial hay equatorial (Bảng 2.1). Với axial ta chỉ có một vị trí là C4, cịn với equatorial có hai vị trí là C2 và C3. Dựa vào phổ IR trong vùng từ 800 đến 1732 cm-1 ta có thể xác định được các nhóm sulfate trong các phân tử đường nằm ở vị trí axial hay equatorial. Phổ IR được đo trên máy FT-IR Brucker tại Viện hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam [26][58][63].
Bảng 2. 1. Các đỉnh phổ đặc trưng của fucoidan trên phổ hồng ngoại
Đỉnh Dao động
775 Dao động dãn vòng của α- anome
802-810 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí C6
822 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí equatorial 845 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí axial 847 Dao động của liên kết C1-H của α- anome
893 Dao động của liên kết C1-H của β- anomer 917 Dao động vòng của α-anome
1030-1167 Dao động hoá trị của hemiacetal
1034 Dao động hoá trị đối xứng của C-O-C 1255-1264 Dao động hoá trị của S=O
1420 Dao động hoá trị đối xứng của C-O-O 1430 Dao dộng gấp của C-H
1730 Dao động hoá trị của C=O 3300-3440 Dao động hoá trị của O-H
2.2.2.8. Phương pháp điện di trên gel carbonhydrate-polyacrilamide
Điện di trên gel carbonhydrate-polyacrilamide (C-PAGE) là một phương pháp được sử dụng để mô tả polysaccharide thành tế bào thực vật như hemicellulose, pectins và các sản phẩm thủy phân của carrageenan, fucoidan. Trong luận văn này, chúng tôi nghiên cứu thêm việc sử dụng C-PAGE để khảo sát sự khác nhau về khối lượng phân tử của Fucoidan được thu nhận từ các phương pháp chiết khác nhau, qua đó có thêm cơ sở để nhận xét sự ảnh hưởng của phương pháp chiết đến hiệu suất thu nhận fucoidan do việc kết tủa trong tỉ lệ 1:4 thể tích cồn 96% của fucoidan phụ thuộc nhiều vào khối lượng
phân tử của chúng, khối lượng phân tử lớn thì khả năng kết tủa trong cồn của fucoidan càng hiệu quả. Ngoài ra, hoạt tính sinh học của fucoidan cũng đã được chứng minh phụ thuộc vào khối lượng phân tử của chúng [5][6][7][8].
Quy trình phân tích C-PAGE được mơ tả như sau. Các fucoidan thô được trộn với 10μL dung dịch đệm chứa 10% glyxerol trong nước và 0,02% phenol đỏ. Điện di các oligosaccharide đã sunfat hóa được thực hiện bằng cách sử dụng gel xếp chồng 5% (w / v) với đệm Tris-HCl 50 mM có pH=6,8 và 27% (w / v) phân giải gel polyacrylamide với đệm Tris-HCl 150 mM có pH=8,8. Nhuộm gel được thực hiện với dung dịch chứa 0,01% O-toluidine xanh lam trong etanol, axit axetic và nước với tỷ lệ thể tích 2:1:1 hoặc với xanh lam alcian và xanh lam toluidine. Quá trình nhuộm các oligomer fucoidan cũng được thực hiện bằng dung dịch nitrat xanh và bạc alcian. Các dải trên điện đồ tương ứng với các oligosaccharide tích điện âm[64].
2.2.3. Phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa của fucoidan
2.2.3.1. Phương pháp xác định hoạt tính oxy hóa tổng số
Khả năng chống oxy hóa tổng được xác định bằng phương pháp Prieto. Lấy 0,5 ml mẫu thêm 0,5 ml nước và 3 ml dung dịch phản ứng (0,6 Mol axit sunfuric, 28 mMol natrisulfate và 4 mMol amoni molydat) được đặt ở 95 oC trong 90 phút. Đo mật độ quang của hỗn hợp phản ứng ở bước sóng 695 nm. Dùng axit ascorbic làm chất chuẩn [65].
2.2.3.2. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa bằng DPPH.
Chuẩn bị hóa chất:
- Dung dịch DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl): Cân 25 mg pha trong 1000 ml ethanol tuyệt đối. Giữ trong bình tối.
- Axit ascorbic: Pha nồng độ 1 mg/ml trong nước. - Các mẫu chất: Pha nồng độ 1 mg/ml trong nước.
Tiến hành kiểm tra hoạt tính chống oxy hóa bằng DPPH: - Mẫu trắng: 1 ml nước cất + 3 ml ethanol tuyệt đối.
- Mẫu âm tính: 1 ml nước cất + 3 ml DPPH.
- Các mẫu kiểm tra: 0,5 ml mẫu chất + 0,5 ml nước cất + 3 ml DPPH. Tất cả các thí nghiệm được lắc đều và để n trong bóng tối 30 phút, sau đó được đo độ hấp thu quang ở bước sóng 517 nm [66]. Khả năng khử gốc tự do DPPH (SC) được xác định theo công thức sau:
2.3. THỰC NGHIỆM
2.3.1. Thu thập và xử lý rong nâu Sargassum mcclurei
Mẫu rong S. mcclurei được thu thập ngay sau thời kì sinh sản vào tháng 6 năm 2020 tại khu vực Hòn Chồng, vịnh Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa. Khi thu, dùng liềm cắt sát gốc cây rong, rửa sạch tạp chất bằng nước biển và phơi khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Khối lượng mỗi mẫu thu tối tiểu là 10kg rong tươi. Các mẫu rong dạng tiêu bản ép khô được lưu trữ tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang.
2.3.2. Chiết fucoidan trong rong nâu Sargassum mcclurei
Trong luận văn này, tiến hành chiết fucoidan từ rong nâu S. mcclurei theo 05 phương pháp gồm:
Chiết fucoidan từ nước nóng theo phương pháp đã trình bày tại Tiểu mục 2.2.1.1.;
Chiết fucoidan bằng dung dịch axit HCl (pH=2-3) theo phương pháp đã trình bày tại Tiểu mục 2.2.1.2.;
Chiết fucoidan bằng dung dịch CaCl2 2% theo phương pháp đã trình bày tại Tiểu mục 2.2.1.3.;
Chiết fucoidan có sự hỗ trợ của enzyme theo phương pháp đã trình bày tại Tiểu mục 2.2.1.4.;
Chiết fucoidan bằng chất lỏng ion theo phương pháp đã trình bày tại
Tiểu mục 2.2.1.5.
2.3.3. Xác định thành phần hóa học của fucoidan
Tiến hành phân tích hàm lượng carbohydrate theo phương pháp đã trình bày tại tiểu mục 2.2.2.1.;
Tiến hành phân tích hàm lượng sulfate theo phương pháp đã trình bày tại
tiểu mục 2.2.2.3.;
Tiến hành phân tích hàm lượng uronic acid theo phương pháp đã trình bày tại tiểu mục 2.2.2.4.;
Tiến hành phân tích hàm lượng polyphenol theo phương pháp đã trình bày tại tiểu mục 2.2.2.5.;
Tiến hành phân tích hàm lượng protein theo phương pháp đã trình bày tại tiểu mục 2.2.2.6.;
Tiến hành phân tích thành phần đường đơn theo phương pháp đã trình bày tại tiểu mục 2.2.2.2.;
Tiến hành phân tích vị trí của nhóm sulfate trong fucoidan theo phương pháp đã trình bày tại tiểu mục 2.2.2.7.
2.3.4. Xác định hoạt tính chống oxy hóa của fucoidan
Tiến hành xác định hoạt tính oxy hóa tổng số của fucoidan theo phương pháp đã trình bày tại tiểu mục 2.2.3.1.;
Tiến hành thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa bằng DPPH theo phương pháp đã trình bày tại tiểu mục 2.2.3.2.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN
Trong luận văn này, chúng tơi phân tích các chỉ tiêu carbohydrate tổng số, hàm lượng sulfate, hàm lượng uronic acid, hàm lượng polyphenol, hàm lượng protein, hàm lượng hoạt tính chống oxy hóa tổng số, thành phần đường đơn bằng các phương pháp truyền thống như trắc quang và phương pháp hiện đại như HPLC... Để phân tích định lượng các chỉ tiêu trên, chúng tôi tiến hành xây dựng đường chuẩn để xác định khoảng tuyến tính và độ tin cậy. Kết quả dẫn ra trên các phụ lục 1, 5, 6, 7, 8.
Kết quả phân tích cho thấy tất cả các giá trị R2 của các phương trình đường chuẩn đều có giá trị ~ 1,0 chứng tỏ các phương trình tuyến tính có độ tin cậy cao. Chúng tơi xác định hàm lượng các chất thơng qua phương trình đường chuẩn và khoảng tuyến tính của nồng độ tương ứng.
3.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN RONG NGUYÊN LIỆU
Để định hướng các phương pháp chiết, đầu tiên, các thành phần hóa học của rong nguyên liệu S. mcclurei được xác định. Kết quả phân tích các
thành phần hóa học của rong nguyên liệu bao gồm: Tro; Độ ẩm; Protein tổng số; Carbohydate tổng số; Fucoidan; Alginate; Polyphenol tổng số và Hàm lượng sulfate tổng số thể hiện ở Bảng 3.1.
Bảng 3. 1. Kết quả phân tích thành phần hóa học của rong nguyên liệu S T T Chỉ tiêu phân tích Đơn vị tính
Kết quả phân tích Giá trị trung bình M1 M2 M3 1 Tro % 37,8 36,8 38,8 37,8 ± 1,0 2 Độ ẩm % 19,4 18,3 20,2 19,3 ± 1,0 3 Protein tổng số % 5,5 5,8 5,9 5,7 ± 0,2 4 Carbohydate tổng số % 35,0 34,5 36,4 35,3 ± 1,0 5 Alginate % 29,9 30,8 32,7 31,1 ± 1,4 6 Polyphenol tổng số % 0,2 0,2 0,2 0,2 ± 0,0
7 Fucoidan % 3,2 3,3 3,6 3,4 ± 0,2
8 Hàm lượng sulfate tổng số % 4,5 4,3 4,7 4,5 ± 0,2
9 Hàm lượng cellulose tổng số % 5,1 5,2 5,4 5,2 ± 0,2 Kết quả tại Bảng 3.1 cho thấy, các thành phần cơ bản trong thành tế bào rong nâu đều hiện diện trong thành phần của rong S. mcclurei. Trong đó, hàm lượng fucoidan khi chiết bằng phương pháp hóa học chiếm 3,4%; alginate chiếm 31,1% và polyphenol tổng số chiếm 0,2%. Để có thể thích nghi với điều kiện sống ở vùng biển nhiệt đới, các thành phần như alginate, fucoidan và polyphenol liên kết chặt chẽ với nhau, liên kết với cellulose để tạo cấu trúc thành tế bào vững chắc [67] (Hình 3.1.).
Hình 3. 1. Mơ hình cấu trúc thành tế bào của rong nâu [67]
Trong các thành phần rong nâu thì fucoidan liên kết chặt chẽ với mạng lưới cellulose và hemicellulose, liên kết với protein và cả với polyphenol thông qua các liên kết hóa học chặt chẽ. Do đó, muốn chiết xuất hiệu quả fucoidan cần có những phương pháp chiết thích hợp. Nguyên tắc của sự chiết xuất là sự thẩm thấu của fucoidan qua thành tế bào vào môi trường chiết (phương pháp chiết axit, nước và CaCl2), bên cạnh đó khi sử dụng enzyme hoặc dùng chất lỏng ion có thể phá vỡ các liên kết của của fucoidan với thành phần khác của thành tế bào như cellulose và hemicellulose có thể dẫn đến nâng cao hiệu suất chiết fucoidan, đồng thời với điều kiện chiết nhẹ nhàng có thể bảo tồn được cấu trúc của fucoidan. Do đó, trong đề tài này, 5 phương
pháp chiết được sử dụng đó là: Chiết bằng nước nóng; Chiết bằng axit HCl (pH=2-3); Chiết bằng dung dịch CaCl2 2%; Chiết có hỗ trợ enzyme và Chiết bằng chất lỏng ion được thực hiện với các nguyên tắc sau:
- Chiết bằng nước nóng: Dựa vào sự thẩm thấu của fucoidan trong môi trường nước, nhiệt độ càng cao thì khả năng hịa tan cao.
- Chiết bằng dung dịch CaCl2 2%: Ion Ca2+ đã kết tủa với các muối alginate hóa trị (I) ở trong tế bào rong nâu về dạng muối canxi alginate không tan, do đó thành phần alginate được cố định trên bã rong và thuận lợi trong quá trình loại bỏ bằng cách lọc.
- Chiết bằng HCl (pH 2-3): Trong môi trường axit, các muối alginate chuyển về dạng axit alginic không tan, do đó thành phần alginate được cố định trên bã rong và thuận lợi trong quá trình loại bỏ bằng cách lọc.
- Chiết có hỗ trợ enzyme: Sử dụng Viscozyme với thành phần gồm cellulase và hemicellulase để phá vỡ thành cellulsose, giải phóng fucoidan vào mơi trường chiết.
- Chiết bằng chất lỏng ion: Chất lỏng ion có thể hịa tan một lượng lớn carbohydrate từ sinh khối của rong nâu, nhiệt độ càng tăng thì khả năng hịa tan càng mạnh, phá vỡ thành cellulsose, giải phóng fucoidan vào mơi trường chiết.
3.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH HIỆU SUẤT CHIẾT FUCOIDAN TỪ RONG
SARGASSUM MCCLUREI BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP KHÁC NHAU
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành chiết fucoidan bằng các phương pháp chiết gồm: chiết bằng nước nóng, chiết bằng dung dịch axit HCl (pH=2-3), chiết bằng dung dịch CaCl2 2%, chiết có sự hỗ trợ của enzyme và chiết bằng chất lỏng ion từ loài rong nâu S. mcclurei được thu nhận vào cùng một thời điểm, cùng một địa điểm (khu vực biển Hòn Chồng, Vịnh Nha Trang vào tháng 06/2020), nhằm đánh giá mức độ ảnh hưởng của phương pháp chiết đến hiệu suất thu nhận fucoidan. Kết quả dẫn ra trên Bảng 3.2.
Bảng 3. 2. Hiệu suất thu nhận fucoidan từ các phương pháp chiết khác nhau Các kết quả Các kết quả thu nhận Phương pháp chiết Chiết bằng nước nóng