CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Rong nâu Sargassum mcclurei
Rong nâu Sargassum mcclurei hay cịn có tên gọi khác là rong mơ hay
rong lá mơ là một loài thuộc ngành rong nâu được phân loài như sau: Ngành: Ochrophyta
Lớp: Phaeophyceae Bộ: Facales
Họ: Sargassaceae Chi: Sargassum
Lồi: Sargassum mcclurei
Rong thuộc nhóm túi khí dạng lá, cao đến 2m. Lá với răng cưa ở mép, có nhiều hình dạng: hình nêm ở gốc, hình trứng đến bầu dục ở phần giữa đến đỉnh. Rong mọc thành thảm lớn trên đá, ở mực triều thấp đến vùng dưới triều, nơi sóng vừa [53].
Rong S. mcclurei phân bố dọc bờ biển nước ta ở khu vực miền trung và phía nam từ tỉnh Quảng Bình đến Bà Rịa – Vũng Tàu. Trên địa bàn tỉnh Khánh Hoà, rong S. mcclurei được ghi nhận phân bố tại nhiều địa điểm khác nhau trải dài từ bắc xuống nam gồm: Mũi Dù, Hịn Khói thuộc vịnh Vân Phong, Vạn Ninh; Mỹ Giang, Ninh Vân, Đầm Nha Phu thuộc thị xã Ninh Hoà; Bãi Tiên – Đường Đệ, Hịn Chồng – Sơng Lơ, Hịn Tre thuộc Vịnh Nha Trang; đảo Bình Ba, Mũi Sốp thuộc vịnh Cam Ranh [20].
Trong luận văn này, rong S. mcclurei được thu thập tại Hòn Chồng -
Vịnh Nha Trang vào tháng 6/2020, ngay sau thời kì sinh sản của rong, thường là khoảng thời gian từ tháng 3 đến tháng 6 hằng năm. Rong S. mcclurei được thu thập và định danh bởi TS. Võ Thành Trung (chuyên gia phân loài rong biển thuộc Viện Nghiên cứu và ứng dụng cơng nghệ Nha Trang).
Hình 2. 1. Rong khơ S. mcclurei
2.1.2. Chuẩn bị hóa chất và thiết bị
2.1.2.1. Hóa chất
- Nước cất 2 lần. - Dung dịch HCl. - CaCl2. - Đệm acetate pH=4,5. - Viscozyme. - Chất lỏng ion BmimCl. - Ethanol 96%. - Phenol.
- Dung dịch H2SO4 đặc 98%. - D-glucose. - Triclorua acetic acid. - Gelatin. - BaCl2. - K2SO4. - NaBH4. - Carbazole.
- D-glucuronic acid. - Thuốc thử Folin Ciocalteu. - Na2CO3. - Phloroglucinol.
- NaOH. - NaK Tartrate.
- CuSO4.5H2O. - Anbumin huyết thanh bò (BSA). - Na2SO4. - Amoni molydat.
2.1.2.2. Thiết bị
- Tủ ấm. - Máy đo mật độ quang. - Máy khuấy từ. - Máy ly tâm.
- Máy thẩm tách màng 10kDa. - Máy cô quay chân không.
- Bếp đun. - Thiết bị điện di DcodeTM (Biorad)
- Cốc, bình chiết, bình tam giác, ống nghiệm chịu nhiệt, pipette… 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp chiết fucoidan
2.2.1.1. Phương pháp chiết fucoidan bằng nước nóng
Phương pháp chiết fucoidan từ rong nâu bằng nước nóng được thực hiện theo phương pháp của Sharmilla và cộng sự [39]. Các mẫu rong nâu
được cắt nhỏ từ 2-3 cm, xử lý loại màu và các hợp chất có trọng lượng phân tử thấp với Ethanol 85%, Aceton, Chloroform theo tỉ lệ w/v=1/10 trong thời gian từ 10-15 ngày, hỗn hợp được lọc tách, thu được rong đã loại chất béo, đem phơi khơ trong khơng khí ở nhiệt độ phịng.
Rong khô đã loại chất béo được xay nhỏ, đem ngâm trong nước nóng (tỉ lệ w/v = 1:20) và giữ ở 60 oC trong 3 giờ. Tiến hành chiết lặp lại ba lần, dịch chiết được gom lại, cho thêm tiếp dung dịch CaCl2, lắc đều và ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ kết tủa. Sau đó, dịch chiết được thẩm tách loại muối bằng màng 10kDa và tủa với 4 lần thể tích ethanol 96% thu được polysaccharide thơ có chứa fucoidan. Sơ đồ chiết được trình bày trên Hình 2.2.
Chiết với (Ethanol, Aceton, Chloroform) Tỉ lệ w/v=1/10, 10-15 ngày
Chiết với H2O nóng, 60 oC, t = 3 giờ (3 lần)
Dung dịch CaCl2,
ly tâm 5000 vòng/phút trong 30 phút
Cô đặc, thẩm tách bằng màng 10kDa Tủa với 3-4 lần thể tích cồn 96%
Hình 2. 2. Sơ đồ chiết fucoidan từ rong nâu bằng nước nóng [39].
2.2.1.2. Phương pháp chiết fucoidan bằng dung dịch HCl (pH:2-3)
Phương pháp chiết fucoidan từ rong nâu bằng dung dịch axit HCl (pH:2-3) được thực hiện theo Bản quyền của Nga (Patent WO 2005/014657) [19]. Rong nâu được xử lý loại các hợp chất màu và chất béo tương tự như sơ đồ được nêu tại Hình 2.2. Mẫu rong đã loại chất béo được chiết với dung môi axit HCl (pH=2), tỉ lệ w/v = 1:20, giữ ở nhiệt độ 60 oC trong thời gian 3 giờ (3 lần). Dịch chiết được gom lại và lọc qua vải lọc, sau đó trung hịa với NaHCO3 đến pH=6-7 và cô quay chân khơng ở nhiệt độ 60 oC, sau đó thẩm tách loại muối bằng màng 10kDa. Dịch chiết sau khi làm sạch được cơ đặc đến 1/10 thể tích ban đầu và được kết tủa với 4 lần thể tích EtOH 96% hoặc đơng khơ thu được bột polysaccharide có chứa fucoidan thơ. Sơ đồ chiết được trình bày trên Hình 2.3.
Dịch chiết fucoidan Dịch chiết rong
Fucoidan thô Rong đã loại chất béo
Rong khô
Polyphenol, chất màu, các hợp chất có trọng lượng phân tử thấp
Bã rong
Muối, kim loại nặng, các hợp chất có trọng lượng phân tử <10kDa
Chiết với (Cồn, Aceton, Chloroform) Tỉ lệ w/v=1/10, 10-15 ngày
Chiết với HCl, pH=2, 60 oC, t = 3 giờ (3 lần)
Trung hòa với NaHCO3 8%, cô đặc thẩm tách bằng màng 10kDa
Tủa với 3-4 lần thể tích cồn 96% hoặc đơng khơ
Hình 2. 3. Sơ đồ chiết fucoidan từ rong nâu
theo Bản quyền của Nga (Patent WO 2005/014657) [19].
2.2.1.3. Phương pháp chiết fucoidan bằng dung dịch CaCl2 2%
Phương pháp chiết fucoidan từ rong nâu bằng dung dịch CaCl2 2% được thực hiện theo phương pháp của Bilan và cộng sự [54]. Rong nâu được xử lý ở nhiệt độ phòng với hỗn hợp MeOH:CHCl3:H2O tỷ lệ 4:2:1 để loại bỏ các chất màu, lọc rửa với aceton, sấy khô. Rong sau khi sấy khô được chiết với CaCl2 2% (3 lần), mỗi lần dung dịch được khuấy trộn ở 85 oC trong 3 giờ. Dịch chiết 3 lần được gom lại, sau đó được thẩm tách loại muối bằng màng 10kDa và được kết tủa với 4 lần thể tích EtOH 96% thu được bột polysaccharide. Sơ đồ chiết được trình bày trên Hình 2.4.
Dịch chiết fucoidan Dịch chiết rong
Fucoidan thơ Rong đã loại chất béo
Rong khô
Polyphenol, chất màu, các hợp chất có trọng lượng phân tử thấp
Bã rong
Muối, kim loại nặng, các hợp chất có trọng lượng phân tử <10kDa
Chiết với (MeOH:CHCl3:H2O=4:2:1)
Chiết với CaCl2 2%, 85 oC t = 3 giờ (3 lần)
Cô đặc, thẩm tách bằng màng 10kDa
Tủa với 3-4 lần thể tích cồn 96%
Hình 2. 4. Sơ đồ chiết fucoidan từ rong nâu
bằng dung dịch CaCl2 2% [54].
2.2.1.4. Phương pháp chiết fucoidan có sự hỗ trợ của enzyme
Phương pháp chiết fucoidan từ rong nâu có sự hỗ trợ của enzyme được thực hiện theo phương pháp của Thuan và cộng sự [55]. Rong nâu được xử lý loại các hợp chất màu và chất béo tương tự như sơ đồ được nêu tại Hình 2.2. Mẫu rong đã loại chất béo được xay nhỏ, bổ sung đệm acetate pH=4,5 có chứa 1% Viscozyme. Bình chiết được cho vào tủ ấm lắc với nhiệt độ 40 oC trong vòng 6 giờ. Tiến hành chiết lặp lại ba lần, dịch chiết được gom lại, cho thêm tiếp dung dịch CaCl2, lắc đều và ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ kết tủa. Dịch chiết sau đó được cơ đặc qua màng 10kDa, được kết tủa với 4 lần thể tích EtOH 96% thu được bột polysaccharide. Sơ đồ chiết được trình bày trên Hình 2.5.
Dịch chiết fucoidan Dịch chiết rong
Fucoidan thô Rong đã loại chất béo
Rong khô
Hợp chất màu, chất béo có trọng lượng phân tử thấp
Bã rong
Muối, kim loại nặng, các hợp chất có trọng lượng phân tử <10kDa
Chiết với (Cồn, Aceton, Chloroform) Tỉ lệ w/v=1/10, 10-15 ngày
Chiết với đệm acetate pH=4,5; 40 oC, Bổ sung 1% viscozyme; t = 6 giờ (3 lần)
Dung dịch CaCl2, ly tâm 5000 vịng/phút
Cơ đặc, thẩm tách bằng màng 10kDa Tủa với 4 lần thể tích cồn 96%
Hình 2. 5. Sơ đồ chiết fucoidan từ rong nâu có sự hỗ trợ của enzyme
2.2.1.5. Phương pháp chiết fucoidan bằng chất lỏng ion
Phương pháp chiết fucoidan từ rong nâu bằng chất lỏng ion được thực hiện theo phương pháp của Pinker và cộng sự[56].
Hình 2. 6. Cơ chế hịa tan xenlulose của BmimCl
(1-butyl-3methylimidazolium chloride) được đề nghị bởi Pinker và cs [56]. Rong nâu được xử lý loại các hợp chất màu và chất béo tương tự như
Dịch chiết fucoidan Dịch chiết rong
Fucoidan thô Rong đã loại chất béo
Rong khô
Polyphenol, chất màu, các hợp chất có trọng lượng phân tử thấp
Bã rong
Muối, kim loại nặng, các hợp chất có trọng lượng phân tử <10kDa
sơ đồ được nêu tại Hình 2.2. Mẫu rong đã loại chất béo được xay nhỏ, tiến hành chiết trong dung dịch chiết là chất lỏng ion với tỷ lệ dung môi: nguyên liệu (ml/g) là 30:1, thời gian chiết là 3 giờ, nhiệt độ chiết là 80 oC. Sau đó, thêm vào dung dịch chiết nước cất nóng và khuấy cho đến khi dung dịch đồng nhất, lọc lấy dung dịch chiết, rồi cho cồn để tủa polysaccharide (Vcồn : Vdịch = 4 : 1). Gạn lọc rồi ly tâm lấy tủa, rửa tủa nhiều lần bằng cồn 85o, 96o. Đông khô thu được fucoidan. Sơ đồ chiết được trình bày trên Hình 2.7.
Chiết với (Ethanol, Aceton, Chloroform) Tỉ lệ w/v=1/10, 10-15 ngày
Chiết với chất lỏng ion, 80 oC, Tỉ lệ (ml/g) = 30:1; t = 3 giờ (3 lần)
Thêm nước cất nóng và khuấy cho đến khi dung dịch đồng nhất Tủa với 4 lần thể tích cồn 96%
Hình 2. 7. Sơ đồ chiết fucoidan từ rong nâu bằng chất lỏng ion [56]. 2.2.2. Phương pháp xác định thành phần hóa học của fucoidan 2.2.2. Phương pháp xác định thành phần hóa học của fucoidan
2.2.2.1. Phương pháp phân tích hàm lượng tổng carbohydrate
Hàm lượng tổng carbohydrate được xác định bằng phương pháp phenol-axit sulfuric. Chuẩn bị dung dịch mẫu có nồng độ carbohydrate thích hợp, lấy 200µl dung dịch mẫu thêm vào 200µl thuốc thử phenol 5% lắc đều đến khi dung dịch trở nên trong suốt thêm tiếp 1ml axit sulfuric đậm đặc lắc đều rồi đem đun cách thủy trong thời gian 5 phút lấy ra để nguội, đo độ hấp thụ quang ở bước sóng λ = 490 nm. Dung dịch chuẩn sử dụng glucose hoặc
Dịch chiết rong
Fucoidan thô Rong đã loại chất béo
Rong khơ
Polyphenol, chất màu, các hợp chất có trọng lượng phân tử thấp
galactose [57].
2.2.2.2. Phương pháp phân tích thành phần đường đơn
Thành phần đường đơn được xác định bằng phương pháp HPLC sau khi fucoidan được thủy phân axit về các monomer và tiến hành xây dựng đường chuẩn dựa trên diện tích pic tương ứng. Mẫu fucoidan (5 mg) cho vào ống nghiệm có nút vặn, thêm 1ml TFA (Triflorua acetic acid) 2M, thủy phân trong 6 giờ ở 100 oC sau đó cho bay hơi đến gần khơ bằng máy cơ quay chân không, rửa lặp lại 3 lần với MeOH để đuổi hết TFA dư. Phần cặn còn lại hòa tan với 1 ml nước đề ion, dung dịch này được dùng để phân tích thành phần đường trên thiết bị phân tích hydrat cacbon IC-500 Biotronik (Germany), sử dụng cột Shim-pack ISA- 07/S2504 (0.4 x 25 cm), pha động là đệm borat kali, tốc độ rửa giải 0.6 ml/phút. Đường đơn được phát hiện bằng phương pháp bicinchorinate trên hệ phân tích Shimadzu C- R2 AX. [58].
2.2.2.3. Phương pháp phân tích hàm lượng sulfate
Hàm lượng sulfate được xác định bằng phương pháp đo độ đục với BaCl2/gelatin. Cân khoảng 5 mg mẫu fucoidan trong một lọ thủy tinh có nút vặn, dung tích 5ml, thêm 2 ml HCl 1N, đem thủy phân ở nhiệt độ 100oC, thời gian 6 giờ. Lấy 10 µl dung dịch mẫu sau thủy phân, thêm vào 100 µl TCA (Triclorua acetic acid) và 100µl hỗn hợp (0,5% gelatin và 0,5% BaCl2), lắc đều và đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 360 nm [59].
2.2.2.4. Phương pháp phân tích hàm lượng uronic acid
Hàm lượng uronic acid được xác định theo phương pháp Carbazol. Lấy 250 μl dung dịch mẫu fucoidan và mẫu so sánh (mẫu carbohydrate không chứa uronic acid) cho vào ống nghiệm, thêm vào 1,5 ml dung dịch A (0,9g NaBH4 trong 10ml nước cất, thêm 90ml H2SO4 và để lạnh qua đêm), phản ứng được tiến hành ở 100 oC trong thời gian 10 phút. Làm lạnh nhanh phản ứng trong cốc nước đá, thêm tiếp 50 μl dung dịch B (100mg carbazole trong 100ml ethanol 96%) lắc đều và cho phản ứng lại ở 100 oC trong 15 phút, làm lạnh nhanh phản ứng đến nhiệt độ phòng và tiến hành đo mật độ quang ở bước sóng λ = 525 nm. Dùng D-glucuronic acid làm chất chuẩn [60].
2.2.2.5. Phương pháp phân tích hàm lượng polyphenol
Hàm lượng polyphenol được xác định theo phương pháp Folin Ciocalteu. Lấy 0,5 ml mẫu thêm 0,5 ml nước, tiếp theo cho vào mẫu 1 ml thuốc thử Folin Ciocalteu và 2 ml Na2CO3 10%. Hỗn hợp ủ trong tối 30 phút. Đo mật độ quang hỗn hợp phản ứng ở bước sóng 750 nm. Dùng Phloroglucinol làm chất chuẩn [61].
2.2.2.6. Phương pháp phân tích hàm lượng protein
Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Lowry. Chuẩn bị hóa chất làm thuốc thử:
- Dung dịch A: Na2CO3 2% trong NaOH 0,1N - Dung dịch B: NaK Tartrate 1% trong nước cất - Dung dịch C: CuSO4.5H2O 0,5% trong nước cất
Lấy 0,5 ml dung dịch mẫu chứa protein với hàm lượng thích hợp, thêm vào đó 2 ml dung dịch D (48ddA:1ddB:1ddC), lắc đều để yên trong 10 phút, sau đó thêm vào hỗn hợp 0,25 ml Folin đã pha loãng 2 lần, lắc đều và để yên trong 30 phút, màu vàng của hỗn hợp chuyển sang màu xanh da trời và đạt đến cường độ cực đại. Đo mật độ quang hỗn hợp phản ứng ở bước sóng 750 nm. Dùng Anbumin huyết thanh bị (BSA) làm chất chuẩn [62].
2.2.2.7. Phương pháp phân tích vị trí của nhóm sulfate trong fucoidan
Vị trí nhóm sulfate được xác định bằng phương pháp phổ IR.
Dựa vào vùng phổ hấp thụ đặc trưng của nhóm sulfate trong phổ hồng ngoại mà ta có thể xác định được vị trí liên kết của nhóm sulfate trong các gốc đường ở vị trí axial hay equatorial (Bảng 2.1). Với axial ta chỉ có một vị trí là C4, cịn với equatorial có hai vị trí là C2 và C3. Dựa vào phổ IR trong vùng từ 800 đến 1732 cm-1 ta có thể xác định được các nhóm sulfate trong các phân tử đường nằm ở vị trí axial hay equatorial. Phổ IR được đo trên máy FT-IR Brucker tại Viện hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam [26][58][63].
Bảng 2. 1. Các đỉnh phổ đặc trưng của fucoidan trên phổ hồng ngoại
Đỉnh Dao động
775 Dao động dãn vòng của α- anome
802-810 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí C6
822 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí equatorial 845 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí axial 847 Dao động của liên kết C1-H của α- anome
893 Dao động của liên kết C1-H của β- anomer 917 Dao động vòng của α-anome
1030-1167 Dao động hoá trị của hemiacetal
1034 Dao động hoá trị đối xứng của C-O-C 1255-1264 Dao động hoá trị của S=O
1420 Dao động hoá trị đối xứng của C-O-O 1430 Dao dộng gấp của C-H
1730 Dao động hoá trị của C=O 3300-3440 Dao động hoá trị của O-H
2.2.2.8. Phương pháp điện di trên gel carbonhydrate-polyacrilamide
Điện di trên gel carbonhydrate-polyacrilamide (C-PAGE) là một phương pháp được sử dụng để mô tả polysaccharide thành tế bào thực vật như hemicellulose, pectins và các sản phẩm thủy phân của carrageenan, fucoidan. Trong luận văn này, chúng tôi nghiên cứu thêm việc sử dụng C-PAGE để khảo sát sự khác nhau về khối lượng phân tử của Fucoidan được thu nhận từ các phương pháp chiết khác nhau, qua đó có thêm cơ sở để nhận xét sự ảnh hưởng của phương pháp chiết đến hiệu suất thu nhận fucoidan do việc kết tủa trong tỉ lệ 1:4 thể tích cồn 96% của fucoidan phụ thuộc nhiều vào khối lượng
phân tử của chúng, khối lượng phân tử lớn thì khả năng kết tủa trong cồn của fucoidan càng hiệu quả. Ngồi ra, hoạt tính sinh học của fucoidan cũng đã được chứng minh phụ thuộc vào khối lượng phân tử của chúng [5][6][7][8].
Quy trình phân tích C-PAGE được mơ tả như sau. Các fucoidan thô được trộn với 10μL dung dịch đệm chứa 10% glyxerol trong nước và 0,02% phenol đỏ. Điện di các oligosaccharide đã sunfat hóa được thực hiện bằng