Phạm Đức Thịnh và cộng sự đã chiết fucoidan từ 5 loài rong S. denticapum, S. polycystum, S. swartzii, S. mcclurei và Turbina ornata và nghiên cứu đặc trưng cấu trúc của các phân đoạn đại diện cho fucoidan của
mỗi loài rong. Tất cả fucoidan chiết từ 5 lồi rong nói trên đều thuộc fucogalactan sulfate với liên kết chủ yếu trong mạch chính là 1-3. Đặc biệt, lần đầu tiên phát hiện ra sự có mặt đồng thời của các gốc →3)-α-L-Fucp và gốc →4)-β-D-Gal liên kết luân phiên trong mạch galactofucan từ rong
Sargassum [19].
Trong luận án của Hồ Đức Cường, fucoidan chiết từ rong nâu
Sargassum henslowianum đã được xác định với thành phần đường chính là fucose và glucose. Cấu trúc hóa học của fucoidan này có mạch chính tạo thành từ α-(1→3)-L-fucose và bị sulfate hóa chủ yếu ở vị trí C2, C4 và một phần của C3 của fucose. Glucose bị sulfate hóa tại vị trí C4 và liên kết với mạch chính qua liên kết glycoside (1 - 4). Đã xác định fucoidan chiết từ rong nâu Sargassum swartzii có cấu trúc mạch nhánh và cấu trúc không gian của cả phân tử và ở kích thước cỡ nano đều có dạng hình que. Bằng cách sử dụng cùng các phương pháp hiện đại như tán xạ ánh sáng (LS) và tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS), cả cấu trúc hóa học và cấu trúc khơng gian của fucoidan được nghiên cứu. Hồ Đức Cường và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính sinh học in vivo (lần đầu tiên ở Việt Nam) và in vitro của fucoidan từ rong nâu Sargassum henslowianum và rong nâu Sargassum swartzii thể hiện hoạt tính
gây độc tế bào yếu trên các dòng tế bào ung thư thử nghiệm nhưng khơng thể hiện hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định. Fucoidan từ rong nâu Sargassum
henslowianum và rong nâu Sargassum swartzii ở liều 100mg/kgP/ngày đã có
tác dụng làm giảm một số chỉ tiêu sinh hố mỡ máu, khối lượng mỡ trên mơ hình chuột béo phì [22].
Đến năm 2017, Bùi Văn Nguyên và cộng sự đã chiết, phân lập, xác định các thành phần cấu tạo và khối lượng phân tử trung bình của các fucoidan từ 6 loài rong nâu của Nha Trang là: S. polycystum (Fsp), S. mcclurei (Fsm), S. oligocystum (Fso), S. denticarpum (Fsd), S. swatzii (Fss),
và T. ornata (Fto) [20].
Điểm nổi bật nhất và mới nhất cho đến hiện nay trong luận án của tác giả Bùi Văn Nguyên là đã nghiên cứu và mô tả được đặc điểm cấu trúc của fucoidan từ hai loài rong Sargassum duplicatum và Sargassum binderi [20].
Các kết quả nghiên cứu phổ IR, NMR (1D và 2D) và ESI-MS/MS chothấy phân đoạn FTD-2,0N từ rong Turbinaria decurrens là một
galactofucan tạo thành từ 2 loại đường (1→3)-α-L-Fuc với nhóm thế sulfate tại vị trí C2 và β-D-galactose mang nhóm sulfate tại vị trí C6. Galactose nối với fucose qua liên kết glucoside 1→4. Mảnh cấu trúc cơ bản của FTD-2,0N được đề xuất như sau:
[→3-α-L-Fucp2(OSO3-)-(1→4)-β-D-Gal6(OSO3-)-1→]n
Hình 1. 8. Mảnh cấu trúc cơ bản fucoidan chiết từ rong Turbinaria decurrens. Bảng 1. 4. Hàm lượng, thành phần hóa học và khối lượng phân tử trung bình
của các mẫu fucoidan phân lập từ 6 loài rong nâu Việt Nam [20].
Tên loài HS (%) Thành phần đường trung bình (% mol) Gluc A (%) Sulfate (%) MW kDa Fuc Man Gal Xyl Glc
S. polycystum 2,70 32,4 2,7 36,3 11,1 10,2 6,8 25,7 52 S. mcclurei 2,10 40,0 2,1 33,1 6,2 20,6 5,2 26,5 26 S. oligocystum 1,60 37,6 1,6 37,0 10,7 7,1 6,5 24,9 38 S. denticarpum 2,20 42,1 2,2 38,9 15,9 2,0 5,8 25,2 41 S. swatzii 0,68 37,0 0,68 34,8 15,5 6,5 7,4 23,4 41 T. ornata 2,75 30,3 vết 9,0 vết vết 7,8 25,6 88
Ngoài ra, Bùi Văn Nguyên và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu hình dáng và kích thước của các mẫu fucoidan bằng phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ. Kết quả phân tích đồ thị Kratky của sự tán xạ tia X góc nhỏ cho thấy các mẫu fucoidan có hình dáng kiểu que (rod-like) với các mạch nhánh cồng kềnh và mức độ phân nhánh khác nhau. Kết quả tính tốn cho các mơ hình lý thuyết cho thấy các mạch nhánh có khả năng nằm kề nhau và có độ dài tới 5 gốc đường.
Tác giả Bùi Văn Nguyên đã thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào của các mẫu fucoidan trên hai dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 và ung thư mô liên kết RD. Kết quả cho thấy các mẫu α đều thể hiện hoạt tính. Hai mẫu có hoạt tính cao nhất là Fto (IC50 đối với Hep-G2 và RD là 3,1 và 1,6 µg/mL) và Fsp (IC50 đối với Hep-G2 và RD là 5,5 và 5,7 µg/mL).
Bảng 1. 5. Hoạt tính gây độc tế bào của các mẫu fucoidan trên các dòng tế
bào ung thư gan Hep-G2 và ung thư mô liên kết RD[20].
Mẫu Fucoidan Hep-G2 RD CS% IC50 (µg/mL) CS% IC50 (µg/mL) S. polycystum 29,7 5,5 11,8 5,7 S. mcclurei 39,3 14,2 64,8 > 20 S. oligocystum 35,3 15,8 11,2 11,4 S. denticarpum 37,5 7.3 27.9 15.9 S. swatzii 31,1 5,8 16,5 18,7 T. ornata 21,8 3,1 4,5 1,6
Năm 2017, nhóm tác giả do Bilan đứng đầu và các cộng sự tại các viện nghiên cứu của Việt Nam đã công bố cấu trúc của fucoidan từ Sargassum aquifolium thu nhận tại vùng biển Việt Nam, bằng phương pháp phân tích
methyl hóa kết hợp phổ NMR các tác giả này đã xác định được 03 polysaccharide có cấu trúc khác nhau sau khi khử sulfate deS-2, deS-4, deS-6. Ngồi ra, nhóm các nhà khoa học này đã sử dụng thêm phương pháp đo phổ NMR, HSQC và chứng minh được rằng fucoidan thu nhận từ rong Sargassum
aquifolium là một polysaccharide sulfate có cấu trúc vơ cùng phức tạp. Thành
phần mạch chính được bắt đầu với fuco(xylo)glucuronomannan, xylo(fuco)glucuronan và fucogalactan, mức độ phân nhánh cao và bất thường. Trong thành phần cấu trúc có chưa các gốc đường mannose, galactose, fucopyranose, xylose, fucofuranose, glucoronic acid và một số lượng lớn nhóm sulfate đính tại các vị trí khác nhau [52].
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Rong nâu Sargassum mcclurei
Rong nâu Sargassum mcclurei hay cịn có tên gọi khác là rong mơ hay
rong lá mơ là một loài thuộc ngành rong nâu được phân loài như sau: Ngành: Ochrophyta
Lớp: Phaeophyceae Bộ: Facales
Họ: Sargassaceae Chi: Sargassum
Lồi: Sargassum mcclurei
Rong thuộc nhóm túi khí dạng lá, cao đến 2m. Lá với răng cưa ở mép, có nhiều hình dạng: hình nêm ở gốc, hình trứng đến bầu dục ở phần giữa đến đỉnh. Rong mọc thành thảm lớn trên đá, ở mực triều thấp đến vùng dưới triều, nơi sóng vừa [53].
Rong S. mcclurei phân bố dọc bờ biển nước ta ở khu vực miền trung và phía nam từ tỉnh Quảng Bình đến Bà Rịa – Vũng Tàu. Trên địa bàn tỉnh Khánh Hoà, rong S. mcclurei được ghi nhận phân bố tại nhiều địa điểm khác nhau trải dài từ bắc xuống nam gồm: Mũi Dù, Hịn Khói thuộc vịnh Vân Phong, Vạn Ninh; Mỹ Giang, Ninh Vân, Đầm Nha Phu thuộc thị xã Ninh Hoà; Bãi Tiên – Đường Đệ, Hịn Chồng – Sơng Lơ, Hịn Tre thuộc Vịnh Nha Trang; đảo Bình Ba, Mũi Sốp thuộc vịnh Cam Ranh [20].
Trong luận văn này, rong S. mcclurei được thu thập tại Hòn Chồng -
Vịnh Nha Trang vào tháng 6/2020, ngay sau thời kì sinh sản của rong, thường là khoảng thời gian từ tháng 3 đến tháng 6 hằng năm. Rong S. mcclurei được thu thập và định danh bởi TS. Võ Thành Trung (chuyên gia phân loài rong biển thuộc Viện Nghiên cứu và ứng dụng cơng nghệ Nha Trang).
Hình 2. 1. Rong khơ S. mcclurei
2.1.2. Chuẩn bị hóa chất và thiết bị
2.1.2.1. Hóa chất
- Nước cất 2 lần. - Dung dịch HCl. - CaCl2. - Đệm acetate pH=4,5. - Viscozyme. - Chất lỏng ion BmimCl. - Ethanol 96%. - Phenol.
- Dung dịch H2SO4 đặc 98%. - D-glucose. - Triclorua acetic acid. - Gelatin. - BaCl2. - K2SO4. - NaBH4. - Carbazole.
- D-glucuronic acid. - Thuốc thử Folin Ciocalteu. - Na2CO3. - Phloroglucinol.
- NaOH. - NaK Tartrate.
- CuSO4.5H2O. - Anbumin huyết thanh bò (BSA). - Na2SO4. - Amoni molydat.
2.1.2.2. Thiết bị
- Tủ ấm. - Máy đo mật độ quang. - Máy khuấy từ. - Máy ly tâm.
- Máy thẩm tách màng 10kDa. - Máy cô quay chân không.
- Bếp đun. - Thiết bị điện di DcodeTM (Biorad)
- Cốc, bình chiết, bình tam giác, ống nghiệm chịu nhiệt, pipette… 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp chiết fucoidan
2.2.1.1. Phương pháp chiết fucoidan bằng nước nóng
Phương pháp chiết fucoidan từ rong nâu bằng nước nóng được thực hiện theo phương pháp của Sharmilla và cộng sự [39]. Các mẫu rong nâu
được cắt nhỏ từ 2-3 cm, xử lý loại màu và các hợp chất có trọng lượng phân tử thấp với Ethanol 85%, Aceton, Chloroform theo tỉ lệ w/v=1/10 trong thời gian từ 10-15 ngày, hỗn hợp được lọc tách, thu được rong đã loại chất béo, đem phơi khơ trong khơng khí ở nhiệt độ phịng.
Rong khô đã loại chất béo được xay nhỏ, đem ngâm trong nước nóng (tỉ lệ w/v = 1:20) và giữ ở 60 oC trong 3 giờ. Tiến hành chiết lặp lại ba lần, dịch chiết được gom lại, cho thêm tiếp dung dịch CaCl2, lắc đều và ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ kết tủa. Sau đó, dịch chiết được thẩm tách loại muối bằng màng 10kDa và tủa với 4 lần thể tích ethanol 96% thu được polysaccharide thơ có chứa fucoidan. Sơ đồ chiết được trình bày trên Hình 2.2.
Chiết với (Ethanol, Aceton, Chloroform) Tỉ lệ w/v=1/10, 10-15 ngày
Chiết với H2O nóng, 60 oC, t = 3 giờ (3 lần)
Dung dịch CaCl2,
ly tâm 5000 vòng/phút trong 30 phút
Cô đặc, thẩm tách bằng màng 10kDa Tủa với 3-4 lần thể tích cồn 96%
Hình 2. 2. Sơ đồ chiết fucoidan từ rong nâu bằng nước nóng [39].
2.2.1.2. Phương pháp chiết fucoidan bằng dung dịch HCl (pH:2-3)
Phương pháp chiết fucoidan từ rong nâu bằng dung dịch axit HCl (pH:2-3) được thực hiện theo Bản quyền của Nga (Patent WO 2005/014657) [19]. Rong nâu được xử lý loại các hợp chất màu và chất béo tương tự như sơ đồ được nêu tại Hình 2.2. Mẫu rong đã loại chất béo được chiết với dung môi axit HCl (pH=2), tỉ lệ w/v = 1:20, giữ ở nhiệt độ 60 oC trong thời gian 3 giờ (3 lần). Dịch chiết được gom lại và lọc qua vải lọc, sau đó trung hịa với NaHCO3 đến pH=6-7 và cô quay chân khơng ở nhiệt độ 60 oC, sau đó thẩm tách loại muối bằng màng 10kDa. Dịch chiết sau khi làm sạch được cơ đặc đến 1/10 thể tích ban đầu và được kết tủa với 4 lần thể tích EtOH 96% hoặc đơng khơ thu được bột polysaccharide có chứa fucoidan thơ. Sơ đồ chiết được trình bày trên Hình 2.3.
Dịch chiết fucoidan Dịch chiết rong
Fucoidan thô Rong đã loại chất béo
Rong khô
Polyphenol, chất màu, các hợp chất có trọng lượng phân tử thấp
Bã rong
Muối, kim loại nặng, các hợp chất có trọng lượng phân tử <10kDa
Chiết với (Cồn, Aceton, Chloroform) Tỉ lệ w/v=1/10, 10-15 ngày
Chiết với HCl, pH=2, 60 oC, t = 3 giờ (3 lần)
Trung hòa với NaHCO3 8%, cô đặc thẩm tách bằng màng 10kDa
Tủa với 3-4 lần thể tích cồn 96% hoặc đơng khơ
Hình 2. 3. Sơ đồ chiết fucoidan từ rong nâu
theo Bản quyền của Nga (Patent WO 2005/014657) [19].
2.2.1.3. Phương pháp chiết fucoidan bằng dung dịch CaCl2 2%
Phương pháp chiết fucoidan từ rong nâu bằng dung dịch CaCl2 2% được thực hiện theo phương pháp của Bilan và cộng sự [54]. Rong nâu được xử lý ở nhiệt độ phòng với hỗn hợp MeOH:CHCl3:H2O tỷ lệ 4:2:1 để loại bỏ các chất màu, lọc rửa với aceton, sấy khô. Rong sau khi sấy khô được chiết với CaCl2 2% (3 lần), mỗi lần dung dịch được khuấy trộn ở 85 oC trong 3 giờ. Dịch chiết 3 lần được gom lại, sau đó được thẩm tách loại muối bằng màng 10kDa và được kết tủa với 4 lần thể tích EtOH 96% thu được bột polysaccharide. Sơ đồ chiết được trình bày trên Hình 2.4.
Dịch chiết fucoidan Dịch chiết rong
Fucoidan thơ Rong đã loại chất béo
Rong khô
Polyphenol, chất màu, các hợp chất có trọng lượng phân tử thấp
Bã rong
Muối, kim loại nặng, các hợp chất có trọng lượng phân tử <10kDa
Chiết với (MeOH:CHCl3:H2O=4:2:1)
Chiết với CaCl2 2%, 85 oC t = 3 giờ (3 lần)
Cô đặc, thẩm tách bằng màng 10kDa
Tủa với 3-4 lần thể tích cồn 96%
Hình 2. 4. Sơ đồ chiết fucoidan từ rong nâu
bằng dung dịch CaCl2 2% [54].
2.2.1.4. Phương pháp chiết fucoidan có sự hỗ trợ của enzyme
Phương pháp chiết fucoidan từ rong nâu có sự hỗ trợ của enzyme được thực hiện theo phương pháp của Thuan và cộng sự [55]. Rong nâu được xử lý loại các hợp chất màu và chất béo tương tự như sơ đồ được nêu tại Hình 2.2. Mẫu rong đã loại chất béo được xay nhỏ, bổ sung đệm acetate pH=4,5 có chứa 1% Viscozyme. Bình chiết được cho vào tủ ấm lắc với nhiệt độ 40 oC trong vòng 6 giờ. Tiến hành chiết lặp lại ba lần, dịch chiết được gom lại, cho thêm tiếp dung dịch CaCl2, lắc đều và ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ kết tủa. Dịch chiết sau đó được cơ đặc qua màng 10kDa, được kết tủa với 4 lần thể tích EtOH 96% thu được bột polysaccharide. Sơ đồ chiết được trình bày trên Hình 2.5.
Dịch chiết fucoidan Dịch chiết rong
Fucoidan thô Rong đã loại chất béo
Rong khô
Hợp chất màu, chất béo có trọng lượng phân tử thấp
Bã rong
Muối, kim loại nặng, các hợp chất có trọng lượng phân tử <10kDa
Chiết với (Cồn, Aceton, Chloroform) Tỉ lệ w/v=1/10, 10-15 ngày
Chiết với đệm acetate pH=4,5; 40 oC, Bổ sung 1% viscozyme; t = 6 giờ (3 lần)
Dung dịch CaCl2, ly tâm 5000 vịng/phút
Cơ đặc, thẩm tách bằng màng 10kDa Tủa với 4 lần thể tích cồn 96%
Hình 2. 5. Sơ đồ chiết fucoidan từ rong nâu có sự hỗ trợ của enzyme
2.2.1.5. Phương pháp chiết fucoidan bằng chất lỏng ion
Phương pháp chiết fucoidan từ rong nâu bằng chất lỏng ion được thực hiện theo phương pháp của Pinker và cộng sự[56].
Hình 2. 6. Cơ chế hịa tan xenlulose của BmimCl
(1-butyl-3methylimidazolium chloride) được đề nghị bởi Pinker và cs [56]. Rong nâu được xử lý loại các hợp chất màu và chất béo tương tự như
Dịch chiết fucoidan Dịch chiết rong
Fucoidan thô Rong đã loại chất béo
Rong khô
Polyphenol, chất màu, các hợp chất có trọng lượng phân tử thấp
Bã rong
Muối, kim loại nặng, các hợp chất có trọng lượng phân tử <10kDa
sơ đồ được nêu tại Hình 2.2. Mẫu rong đã loại chất béo được xay nhỏ, tiến hành chiết trong dung dịch chiết là chất lỏng ion với tỷ lệ dung môi: nguyên liệu (ml/g) là 30:1, thời gian chiết là 3 giờ, nhiệt độ chiết là 80 oC. Sau đó, thêm vào dung dịch chiết nước cất nóng và khuấy cho đến khi dung dịch đồng nhất, lọc lấy dung dịch chiết, rồi cho cồn để tủa polysaccharide (Vcồn : Vdịch = 4 : 1). Gạn lọc rồi ly tâm lấy tủa, rửa tủa nhiều lần bằng cồn 85o, 96o. Đông khô thu được fucoidan. Sơ đồ chiết được trình bày trên Hình 2.7.
Chiết với (Ethanol, Aceton, Chloroform) Tỉ lệ w/v=1/10, 10-15 ngày
Chiết với chất lỏng ion, 80 oC, Tỉ lệ (ml/g) = 30:1; t = 3 giờ (3 lần)
Thêm nước cất nóng và khuấy cho đến khi dung dịch đồng nhất Tủa với 4 lần thể tích cồn 96%
Hình 2. 7. Sơ đồ chiết fucoidan từ rong nâu bằng chất lỏng ion [56]. 2.2.2. Phương pháp xác định thành phần hóa học của fucoidan 2.2.2. Phương pháp xác định thành phần hóa học của fucoidan
2.2.2.1. Phương pháp phân tích hàm lượng tổng carbohydrate
Hàm lượng tổng carbohydrate được xác định bằng phương pháp phenol-axit sulfuric. Chuẩn bị dung dịch mẫu có nồng độ carbohydrate thích hợp, lấy 200µl dung dịch mẫu thêm vào 200µl thuốc thử phenol 5% lắc đều đến khi dung dịch trở nên trong suốt thêm tiếp 1ml axit sulfuric đậm đặc lắc đều rồi đem đun cách thủy trong thời gian 5 phút lấy ra để nguội, đo độ hấp thụ quang ở bước sóng λ = 490 nm. Dung dịch chuẩn sử dụng glucose hoặc
Dịch chiết rong
Fucoidan thô Rong đã loại chất béo
Rong khơ
Polyphenol, chất màu, các hợp chất có trọng lượng phân tử thấp
galactose [57].
2.2.2.2. Phương pháp phân tích thành phần đường đơn
Thành phần đường đơn được xác định bằng phương pháp HPLC sau khi fucoidan được thủy phân axit về các monomer và tiến hành xây dựng