CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.CHIẾT TÁCH VÀ PHÂN LẬP FUCOIDAN TỪ RONG NÂU
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành tách chiết Fucoidan bằng dung dịch HCl 0,01N từ loài rong Sargassum microcystum, thu cùng một thời điểm nhưng thu ở 2 địa điểm khác nhau nhằm đánh giá mức độ ảnh hưởng của môi trường đến hàm lượng Fucoidan. Kết quả được dẫn ra trên bảng 3.1.
Bảng 3.1. Hàm lượng thu nhận và thành phần hóa học Fucoidan từ hai khu vực
biển khác nhau Các kết quả
thu nhận
Nơi thu hái rong
Hòn Rùa Bãi Trù - Vinpearland
Khối lượng rong khô đã chiết(g)
500 500
Khối lượng fuoidan thô thu được(g)
9,03 7,25
Hàm lượng thu nhận(%) 1,80 1,45
Kết quả thực nghiệm cho thấy hàm lượng Fucoidan thô đối với những địa điểm thu khác nhau sẽ khác nhau. Fucoidan thô được chiết tách thu nhận từ rong nâu Sargassum microcystum trong dung mơi HCl 0,01N tại Hịn Rùa (1,80%) cao hơn rong thu tại Bãi Trù - Vinpearland (1,45%) so với trọng lượng rong khô đã được xử lý loại bỏ các hợp chất màu và lipid. Nguyên nhân dẫn đến sự khác nhau về hàm lượng thu nhận Fucoidan có thể là do ở mỗi khu vực sống khác nhau, điều kiện môi trường khác nhau dẫn đến quá trình sinh tổng hợp các hợp chất trong rong cũng khác nhau.
1 Bảng 3.2. Hàm lượng Fucoidan thu nhận từ 06 loài rong nâu Việt Nam[62,65] Stt Loài rong Hàm lượng Fucoidan % 1 S.swartzii 0,82 2 S.oligocystum 1,80 3 S.denticapum 2,00 4 S.mcclurei 2,37 5 S.polycystum 2,57 6 S.binderi 1,13
So với các kết quả về hàm lượng Fucoidan đã được cơng bố trước đó của các lồi rong sinh trưởng tại Việt Nam, trong cùng chi Sargasum như S.swartzii, S.oligocystum, S.denticapum, S.mcclurei, S.polycystum, S.binderi lần lượt là 0,82 %, 1,80 %, 2,00 %, 2,37 %, 2,57 %, 1,13 % có thể thấy hàm lượng Fucoidan trong cùng một chi rong lại khác nhau. Kết quả bảng 3.2 cho thấy hàm lượng thu nhận Fucoidan thô từ rong S. microcystum thấp hơn Fucoidan chiết từ các loài S.denticapum, S.mcclurei, S.polycystum và cao hơn một số rong S.binderi, S.swartzii trong cùng chi.
Bảng 3.3. Hàm lượng Fucoidan thu nhận từ 07 loài rong nâu thế giới
Stt Loài rong Nơi thu mẫu
Hàm lượng Fucoidan % TLTK 1 Sargassum stenophyllum Brazil 0,14 [73] 2 Sargassum ringgoldianum Brazil 0,13 [74] 3 Sargassum ringgoldianum Brazil 0,88 [75] 4 Sargassum fusiformis (Hizikia fusiformis) Nhật Bản 1,3 [76] 5 Sargassum myriocystum Nhật Bản 5,34 [77] 6 Sargassum wightii Ấn Độ 6,72 [78] 7 Sargassum horneri Mexico 4,3 [78]
So với các loài rong nâu thuộc chi Sargassum của các nước khác trên thế giới như Mexico, Brazil, Nhật Bản, Ấn Độ, Trung Quốc,… hàm lượng Fucoidan của rong nâu S. microcystum thu nhận tại Việt Nam cao hơn so với loài rong
1,30 % của Nhật Bản và thấp hơn các loài rong, Sargassum myriocystum 5,34 %,
Sargassum wightii 6,72% (Ấn Độ), Sargassum horneri 4,3 % (Mexico). Sự khác biệt về hàm lượng Fucoidan trong các lồi rong rất khó để đưa ra so sánh, bởi hàm lượng Fucoidan thu được nhìn chung thay đổi rất nhiều (0,1-20%) phụ thuộc vào điều kiện địa lý, quá trình sinh trưởng và phát triển, cũng như phương pháp chiết tách để thu nhận Fucoidan.
3.2. PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HĨA HỌC
3.2.1. Xây dựng đường chuẩn
Chúng tơi phân tích thành phần Fucoidan bao gồm : carbohydrate, sulfate và uronic acid bằng phương pháp truyền thống là xây dựng đường chuẩn và xác định mật độ quang của các chất cần phân tích. Kết quả xây dựng đường chuẩn các chất được dẫn ở phụ lục 1, phụ lục 2 và phụ lục 3.
Phân tích thành phần monosaccharide trong fuocidan bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), xây dựng đường chuẩn dựa trên diện tích peak tương ứng. Sử dụng điều kiện phân tích mẫu trên hệ thống sắc kí ion ICS – 6000 (Thermoscientific), sử dụng cột phân tích trao đổi anion CarboPac MA1(50mm x 4); đầu dị điện hóa (Electrochemical Detector – ED), pha động NaOH 1M, tốc độ dịng 0,4mL/ phút, thể tích tiêm mẫu 500 µL, thời gian phân tích là 30 phút, chúng tôi thu được sắc lý đồ trên hình 3.1 cho thấy các mẫu chuẩn bao gồm (Fucose, Arabinose, Glucose, Galactose) các peak có đỉnh nhọn hồn tồn tách biệt nhau.
đường chuẩn để xác định hàm lượng các thành phần monosaccharide theo các phụ lục 4,5,6,7.
3.2.2. Phân tích thành phần hóa học của Fucoidan
Để lựa chọn mẫu Fucoidan cho các nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi tiến hành phân tích sơ bộ thành phần hóa học của 02 mẫu Fucoidan chiết từ loài rong
S.microcystum thu tại 02 địa điểm khác nhau.
2 Bảng 3.4. Hàm lượng thu nhận và thành phần hóa học Fucoidan từ hai khu vực
biển khác nhau Các kết quả
thu nhận
Nơi thu hái rong
Hòn Rùa Bãi Trù - Vinpearland
Hàm lượng carbohydrate tổng(%)(**) 36,06 24,4 Hàmlượng sulfate (%)(**) 19,16 25,54 Hàm lượng uronic axit(%)(**) 9,00 10,98
** Hàm lượng tính theo khối lượng mẫu Fucoidan thơ phân tích
Theo kết quả phân tích bảng 3.4 , mẫu Fucoidan thu nhận tại Hịn Rùa có hàm lượng carbohydrate cao hơn gần 1,5 lần so với mẫu rong thu hái tại Bãi Trù. Tuy nhiên hàm lượng sulfate của mẫu rong này lại thấp hơn so với mẫu Fucoidan được chiết tách với mẫu rong thu hái tại Bãi Trù. Sự khác biệt này rất đáng kể. Hàm lượng uronic axit của cả 2 mẫu Fucoidan cũng có sự khác nhau tuy nhiên không đáng kể. Theo các nghiên cứu của các nhà khoa học trước đây cho thấy sulfate và uronic axit là hai trong những yếu tố có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính sinh
pháp chiết Fucoidan bằng dung mơi axit lỗng cũng là phương pháp được lựa chọn trong nhiều nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính sinh học của Fucoidan đã được công bố.
Sau khi lựa chọn được Fucoidan chiết tách từ rong nâu S.microcystum thu
hái tại Bãi Trù, chúng tơi tiến hành phân tích thành phần polysaccharide , kết quả dẫn ra trên bảng 3.5.
Các kết quả phân tích trong bảng 3.5 cho thấy hàm lượng carbohydrate, sulfate và uronic axit của mẫu Fucoidan được chiết tách từ rong S.microc stum lần
l ợt tương ứng là 24,40 %; 25,54 % và 10,98%.
Kết quả bảng 3.5 cho thấy mẫu Fucoidan thô được thu nhận từ rong nâu
Sargassum microcystum trước khi chạy sắc kí phân đoạn ngồi ba thành phần
chính là fucose (36,10%) và galactose (22,40%), glucose (40,80%), cịn có thêm các đường đơn khác với hàm lượng rất nhỏ Arabinose (0,6%), không chứa N- Acetyl-galactosamine.
3 Bảng 3.5. Thành phần hóa học mẫu Fucoidan chiết từ rong S.microcystum
Kí hiệu mẫu
Thành phần đường đơn của Fucoidan (mol %) Cacbo hydrate % w/w** SO42- % w/w* * Uronic axit % w/w**
Fuc Gal Glu N-Acetyl
galactosamine Arabinose PS- S.micro cystum 36,10 22,04 40,80 nd 0,60 24,40 25,54 10,98
Fucoidan phân lập từ 6 loài cùng chi với S.microcystum rong nâu Việt Nam [67]. Tên lồi HS (%) Thành phần đường trung bình (% mol) Gluc A (%) Sulfate (%)
Fuc Man Gal Xyl Glc
S. polycystum 2,70 32,4 2,7 36,3 11,1 10,2 6,8 25,7 S. mcclurei 2,10 40,0 2,1 33,1 6,2 20,6 5,2 26,5 S. oligocystum 1,60 37,6 1,6 37,0 10,7 7,1 6,5 24,9 S. denticarpum 2,20 42,1 2,2 38,9 15,9 2,0 5,8 25,2 S. swatzii 0,68 37,0 0,68 34,8 15,5 6,5 7,4 23,4 S.binderi 1,13 42,2 10,3 38,0 9,5 0
Các kết quả phân tích trong bảng 3.5 và 3.6 cho thấy mẫu Fucoidan thu nhận từ rong Sargassum microcystum do chúng tôi tiến hành khảo sát so với kết quả đã được công bố về Fucoidan của các loài rong trong cùng chi do tác giả Bùi Văn Nguyên, Phạm Đức Thịnh và các cộng sự [65,66,67] thu nhận chúng ta có thể nhận thấy, tỉ lệ giữa các gốc đường giữa các loài rong trong cùng chi khác nhau rất nhiều. Theo nhóm tác giả này, thành phần đường của mẫu Fucoidan được chiết tách từ các loài rong cùng chi Sargassum chứa chủ yếu đường fucose và galactose với tỉ lệ 1:1, gốc đường glucose chiếm 1 tỉ lệ rất nhỏ. Trong khi đó, thành phần đường đơn từ mẫu Fucoidan của lồi rong Sargassum microcystum tơi đã thu nhận và nghiên cứu ngồi hai thành phần chính đường Fucose (36,1%) và Galactose (22,4%) giống như các tác giả trước đó đã nghiên cứu với tỉ lệ 3:2 thì điểm khác
7,1%,S. denticarpum với hàm lượng glucose 2%,S. swatzii với hàm lượng glucozo 6,5%, S.binderi kh ng chứa glucose...) . Như vậy, hàm lượng các gốc đường này biến đổi theo từng thời điểm, vị trí địa lí thu rong, trong từng chi rong và từng lồi rong khác nhau. Các kết quả này cũng hoàn toàn phù hợp với các cơng bố trước đó về sự đa dạng của thành phần hóa học của Fucoidan. Kết quả phân tích thành phần đường chỉ ra rằng Fucoidan của các loài rong thuộc các chi rong khác nhau là khác nhau, các loài rong thuộc cùng một chi rong hay trong cùng một loài rong cũng khác nhau về thành phần và tỉ lệ mol giữa các gốc đường đơn. Những đặc điểm này tạo ra sự đa dạng cấu trúc cũng như hoạt tính sinh học của Fucoidan, nhưng đồng thời cũng làm cho việc phân tích chi tiết cấu trúc của Fucoidan trở nên vơ cùng phức tạp. Đó chính là lý do tại sao cho đến nay trên thế giới mới chỉ có một vài cơng bố về cấu trúc hồn chỉnh của Fucoidan, nhưng khơng một cơng bố nào đưa ra được mối liên hệ có tính quy luật cho cấu trúc Fucoidan với các bộ rong.
Sự khác nhau này có thể được giải thích do sự khác nhau về vị trí và thời gian thu mẫu. Điều này cho thấy thành phần cũng như đặc điểm cấu trúc của Fucoidan vô cùng phức tạp.
Theo các cơng bố [63,64,65,66,67] thì các Fucoidan của các lồi rong tại các vùng biển Việt Nam đều có một đặc điểm chung là bên cạnh hàm lượng sulfate cao, hai gốc đường fucose và galactose luôn chiếm hàm lượng lớn hơn so với các gốc đường khác, với đặc điểm này chúng được gọi là các galactofucan sulfate hóa.
So với Fucoidan chiết từ các loài rong nâu khác trên thế giới như Nga, Nhật Bản, Hàn Quốc,... thì Fucoidan chiết từ rong nâu Việt Nam có sự khác biệt lớn về thành phần các đường đơn. Đó là hàm lượng fucose thấp hơn. Fucoidan phân lập từ một số lồi rong nâu của vùng Viễn Đơng, L.B.Nga có hàm lượng fucose cao hơn rất nhiều như Fucoidan chiết tách từ rong Fucus evanescens, Laminaria japonica
và Laminaria cichorioides có hàm lượng fucose (tính theo carbohydrate) lần lượt là 88%, 86% và 100% [37,53], hay Fucoidan chiết từ rong Hizikia fusiformis
(Nhật Bản) hàm lượng fucose chiếm 80%, Fucoidan của từ rong Sargassum stenophyllum (Brazil) hàm lượng fucose chiếm 67,8%, hiện nay loại Fucoidan duy
Fucus vesiculosus có hàm lượng fucose chiếm 100%. Điều này cho thấy sự đa dạng về thành phần hóa học của Fucoidan trong các lồi rong khác nhau, thậm chí là trong cùng một chi rong Sargassum của Việt Nam và của Brazil cũng có thành phần rất khác nhau. Nhìn chung Fucoidan của rong nâu sinh trưởng ở vùng biển ôn đới thường có thành phần đường tương đối đơn giản, chúng hầu như chỉ có một gốc đường fucose và một lượng rất nhỏ các đường đơn khác. Trong khi đó Fucoidan của rong nâu ở biển nhiệt đới nói chung và biển Việt Nam nói riêng phần lớn thuộc nhóm galactofucan, trong thành phần chủ yếu chứa hai gốc đường fucose và galactose cùng với một lượng nhỏ các gốc đường khác như rhamnose, xylose, mannose, glucose. Sự khác nhau về thành phần và hàm lượng các đường đơn của Fucoidan từ các loài rong khác nhau một lần nữa khẳng định rằng điều kiện mơi trường có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh tổng hợp polysaccharide của rong nâu.
3.2.3. Tách phân đoạn và thành phần hóa học các phân đoạn Fucoidan
Fucoidan là polymer tự nhiên có cấu trúc phức tạp mà trong thành phần hóa học của chúng ln chứa các nhóm điện tích như gốc sulfate, gốc acetyl. Sự có mặt của chúng là một trong những yếu tố quan trọng xác định tính chất hóa lý cũng như sinh học của Fucoidan. Sự phân bố hàm lượng carbonhydrate theo nhóm điện tích (nhóm sulfate, nhóm acetyl) thường được nghiên cứu bằng phương pháp tách phân đoạn trên nhựa trao đổi ion (dạng anion hoặc cation) dùng dung dịch rửa giải là chất điện ly. Kết quả nhận được của quá trình tách phân đoạn này là các phân đoạn rửa giải sẽ chứa các polymer tự nhiên có cấu trúc tương tự nhau về hàm lượng cũng như vị trí sắp xếp của các nhóm điện tích.
Trong luận văn này chúng tôi dùng nhựa trao đổi anion trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose (3,2 x 32 cm), rửa giải gradient với dung dịch NaCl từ 0,1M đến 2,0M và thu lấy 5 phân đoạn. Quá trình sắc ký được biểu diễn trên hình 3.2.
5 Hình 3.2. Phân đoạn Fucoidan được chiết từ rong S.microcystum bằng sắc ký
trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose.
Bảng 3.7. Hàm lượng thu nhận các phân đoạn Fucoidan Kí hiệu mẫu Khối lượng mẫu
thu nhận Hàm lượng thu nhận(%) Cơng thức tính F1 20,5(mg) 4,12 (20,5x100):500 F2 22,4(mg) 4,48 (22,4x100):500 F3 78,15(mg) 15,63 (78,15x100): 500 F4 54,68(mg) 10,94 (54,68x100):500 F5 45,80(mg) 9,16 (45,80x100):500
Kết quả tách phân đoạn Fucoidan từ rong S. microcystum (hình 3.2) ta thấy
có 05 phân đoạn F1, F2, F3, F4 và F5 được tách ra với các nồng độ rửa giải khác nhau của muối NaCl lần lượt là 0,3N; 0,5N; 0,8N; 1,0N và 1,5N. Với 05 phân đoạn thu được sau khi tách sắc ký cho thấy khả năng rong nâu S.microcystum sinh tổng hợp nên 5 dạng loại Fucoidan khác nhau. So với kết quả phân đoạn thu được của Fucoidan từ các loài rong khác thuộc chi Sagassum có thể thấy mỗi loài rong khác nhau sẽ tổng hợp lên các loại Fucoidan với nhiều dạng cấu trúc khác nhau. Các phân đoạn Fucoidan được tách ra bằng sắc ký trao đổi anion chủ yếu phụ thuộc vào mật độ nhóm mang điện tích (nhóm sulfate). Điều này có thể được giải thích là do hàm lượng sulfate càng lớn thì khả năng liên kết với nhựa trao đổi anion DEAE- Cellulose (Diethylaminoethyl-cellulose) càng mạnh, vì vậy để giải phóng phân đoạn Fucoidan này cần dung dịch rửa giải có nồng độ muối cao hơn. Chính vì lý do này mà các phân đoạn Fucoidan từ mỗi loài rong khác nhau tùy thuộc vào mật độ nhóm sulfate sẽ được rửa giải ra ở các nồng độ muối NaCl khác nhau.
7 Hình 3.4. Sắc ký đồ HPLC xác định thành phần đường đơn phân đoạn F3
8 Hình 3.5. Sắc ký đồ HPLC xác định thành phần đường đơn phân đoạn F4
Bảng 3.8 : Thành phần hóa học của các phân đoạn Fucoidan chiết từ rong Sargassum microcystum. Phân đoạn Hiệu suất (%) SO3Na % Uronic Axit % Thành phần monosaccharide (mM) (tỷ lệ mol)
Fucose Galactose GalN Arabinose Gluco
Fucoidan thô 25,5 10,98 1 0,62 - 0,16 1,13 F1 4,12 13,54 5,04 1 0,78 0,07 0,072 0,76 F2 4,48 19,40 4,28 1 0,63 0,03 - 0,62 F3 15,63 22,80 14,86 1 0,31 - - 0,51 F4 10,94 28,94 5,22 1 0,31 - - - F5 9,16 32,94 14,8 1 0,34 - - -
Kết quả bảng 3.8 cho thấy hiệu suất tách phân đoạn là 44,33% và hiệu suất tách phân đoạn từ F1 đến F5 lần lượt là 4,12%; 4,48%; 15,63%; 10,94% và 9,16%. Cao nhất là phân đoạn F3 và thấp nhất nhất là phân đoạn F1 và F2. Hàm lượng sulfate tăng dần từ phân đoạn F1 đến phân đoạn F5, chúng dao động từ 13,54% - 32,94%. Điều này có thể được giải thích khi hàm lượng gốc sulfate trong các phân đoạn càng cao thì khả năng liên kết với nhựa trao đổi anion DEAE-Cellulose (Diethylaminoethyl-cellulose) càng mạnh nên cần rửa giải các phân đoạn sau cần nồng độ rửa giải của muối cao hơn. Tuy nhiên hàm lượng uronic acid thay đổi không theo sự thay đổi của nhóm sulfate là theo sự tăng dần nồng độ chất điện ly của dung dịch rửa giải mà thay đổi không theo quy luật. Hàm lượng uronic cao
trong Fucoidan thô chiết từ rong Sargassum microcystun.
Thành phần đường của Fucoidan và các phân đoạn bao gồm fucose, galactose, glucose, arabinose. Trong đó thành phần chính của Fucoidan thơ là fucose, galactose, glucose, arabinose, sulfat với tỷ lệ mol là 1 : 0,62 : 0,16 :0,72 và lượng nhỏ hợp chất N-Acetylgalactosamine. Ngoài thành phần đường Fucoidan cịn có 02 thành phần mang điện tích là nhóm sulfate và nhóm acetyl (axit uronic). Fucose có trong thành phần của tất cả các phân đoạn và đặc biệt là sự có mặt đường galactose trong trong tất cả các phân đoạn với hàm lượng biến đổi từ 0,31 đến 0,78 Mmol chứng tỏ rằng Fucoidan chiết từ loài rong Sargassum microcystum
là dạng sulfate galactofucan. Phân đoạn F1, F2 và F3 ngồi 2 thành phần chính chủ yếu là fucose và galactose còn chứa một lượng tương đối lớn glucose và một