ở các vị trí khác nhau trong phổ khối dạng ion âm Vị trí
0,2A 0,3A 0,4A 0,2X 0,3X 0,4X sulfate
2-O- 103 73 43 139 169 199
3-O- 183 73 43 59 169 199
4-O- 183 153 43 59 89 199
n,m
A, n,mX: cắt theo liên kết n,m của vịng đường như hình 2.3. THỰC NGHIỆM
2.3.1. Chiết tách và phân đoạn tinh chế Fucoidan từ rong nâu
* Chiết tách Fucoidan từ rong nâu Sargassum microc stum trong dung môi HCl 0,01N
Các mẫu rong được cắt nhỏ (2-3 cm), xử lý loại màu và các phân đoạn trọng lượng phân tử thấp với hỗn hợp (96% EtOH : Cloroform : H2O = 89 : 1 : 10) theo tỉ lệ w/v = 1/10 trong thời gian 10-15 ngày, hỗn hợp được lọc tách, rong được phơi khơ trong khơng khí ở nhiệt độ phịng.
Mẫu rong sau khi đã loại chất béo và các hợp chất màu (500 g) được tiến hành chiết 3 lần với 15 lít dung dịch HCl 0,01N (pH 2-3) ở nhiệt độ 60o
C trong thời gian 2h với mỗi lần chiết. Dịch chiết được lọc tách thô qua vải lọc, dịch chiết chứa các polysaccharide tan trong nước của 3 lần chiết được gộp lại và trung hòa bằng dung dịch NaHCO3 8% đến pH = 6-7. Dịch chiết sau trung hòa được loại bớt nước bằng máy cô quay chân không ở nhiệt độ 50-60oC. Sau đó, chúng tơi lại tiến hành cô đặc và làm sạch dịch chiết bằng màng thẩm tách kích thước 10kDa để thẩm tách loại muối, các hợp chất màu và các tạp chất trọng lượng phân tử thấp
Vethanol = 1:4 hoặc đông khô bằng cách sử dụng máy đông khô chân không ta thu được bột polysaccharide dạng thô chứa Fucoidan.
* Phân oạn tinh chế Fucoidan bằng sắc ký trao ổi anion
Cân 0,5g bột polysaccharide thô gồm (Fucoidan, laminaran và polyuronan) hòa tan trong dung dịch HCl 0,04N, ly tâm tách phần tủa không tan ta loại được polyuronan (PA) dưới dạng kết tủa axít polyuronic, phần dịch trong đưa lên cột DEAE-Cellulose (dạng Cl-, 3,0 x 32 cm). Đầu tiên rửa cột với dung dịch HCl 0,04N đến khi thử âm tính với hydrate cacbon bằng phương pháp phenol-axít sulfuric ta thu được phân đoạn laminaran, tiếp theo rửa giải cột bằng muối NaCl theo gradient tuyến tính liên tục nồng độ tăng dần từ 0-2N, các phân đoạn Fucoidan (F1, F2, F3, F4, F5) được tách ra theo các nồng độ rửa giải khác nhau của dung dịch muối NaCl, mỗi phân đoạn thu được cho thẩm tách loại muối bằng màng thẩm tách kích thước 10kDa trong nước cất sau thời gian 24h, sau đó đem đông khô để thu các phân đoạn Fucoidan dạng bột.
2.3.2. Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate
Cân 5 (mg) bột Fucoidan thơ hịa tan vào nước cất thành 1mL. Lấy 200 µL dung dịch cần xác định có hàm lượng carbohydrate trong khoảng 20-100 µg/mL, thêm vào 200µL thuốc thử phenol 5% lắc đều đến khi dung dịch trở nên trong suốt, thêm tiếp 1mL axít sulfuric đậm đặc lắc đều rồi đem đun cách thủy trong thời gian 5 phút, lấy ra để nguội, đo độ hấp thụ quang ở bước sóng λ = 490 nm. Sử dụng D- glucose làm chất chuẩn [68].
2.3.3. Phân tích thành phần monosaccharide
Mẫu Fucoidan (5 mg) cho vào ống nghiệm có nút vặn dung tích 5mL, thêm 1mL TFA (Triflorua acetic axít) 2M lắc đều cho tan, đem thủy phân ở 100o
C trong 6 giờ sau đó cho bay hơi đến gần khô bằng máy cô quay chân không, rửa lặp lại 3 lần với MeOH để đuổi hết TFA dư. Phần cặn còn lại hòa tan với 1 mL nước đề ion, dung dịch này được dùng để phân tích thành phần đường bằng phương pháp
lượng các đường đơn được tính theo % mol dựa vào các chất chuẩn.
2.3.4. Phân tích hàm lượng sulfate
Cân 5 (mg) mẫu trong một lọ thủy tinh có nút vặn dung tích 5mL, thêm vào 2 mL HCl 1N, đem thủy phân ở nhiệt độ 100oC, trong thời gian 6 giờ. Lấy 10 μL dung dịch mẫu sau thủy phân, thêm vào 100 μL TCA (Trichlorua acetic axít ) và 100μL hỗn hợp (0,5% gelatin + 0,5% BaCl2) lắc đều rồi đo độ hấp thụ quang ở bước sóng λ= 360 nm. Hàm lượng sulfate được tính dựa vào đường chuẩn dựng từ dung dịch K2SO4 với khoảng nồng độ từ 0,25-1 μg/mL [69].
2.3.5. Phân tích hàm lượng uronic axit
Cân 5 (mg) bột Fucoidan thơ hịa tan vào nước cất thành 1mL. Lấy 250 μL dung dịch mẫu (mẫu Fucoidan và mẫu so sánh (mẫu carbohydrate không chứa uronic axit)) cho vào ống nghiệm, thêm vào 1,5 mL dung dịch A (0,9 g NaBH4 hòa tan trong 10 mL nước cất, thêm vào từ từ 90 mL dung dịch axít sulfuric 98% đã được làm lạnh), phản ứng được tiến hành ở 100oC trong thời gian 10 phút. Làm lạnh nhanh phản ứng trong cốc nước đá, thêm tiếp 50 μL dung dịch B (100 mg Carbazole được hòa tan trong 100 mL cồn tuyệt đối) lắc đều và cho phản ứng lại ở 100oC trong 15 phút, làm lạnh nhanh phản ứng đến nhiệt độ phịng và tiến hành đo quang ở bước sóng λ = 525 nm. Sử dụng D-glucuronic axít làm chất chuẩn [70].
3.1. CHIẾT TÁCH VÀ PHÂN LẬP FUCOIDAN TỪ RONG NÂU
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành tách chiết Fucoidan bằng dung dịch HCl 0,01N từ loài rong Sargassum microcystum, thu cùng một thời điểm nhưng thu ở 2 địa điểm khác nhau nhằm đánh giá mức độ ảnh hưởng của môi trường đến hàm lượng Fucoidan. Kết quả được dẫn ra trên bảng 3.1.
Bảng 3.1. Hàm lượng thu nhận và thành phần hóa học Fucoidan từ hai khu vực
biển khác nhau Các kết quả
thu nhận
Nơi thu hái rong
Hòn Rùa Bãi Trù - Vinpearland
Khối lượng rong khô đã chiết(g)
500 500
Khối lượng fuoidan thô thu được(g)
9,03 7,25
Hàm lượng thu nhận(%) 1,80 1,45
Kết quả thực nghiệm cho thấy hàm lượng Fucoidan thô đối với những địa điểm thu khác nhau sẽ khác nhau. Fucoidan thô được chiết tách thu nhận từ rong nâu Sargassum microcystum trong dung mơi HCl 0,01N tại Hịn Rùa (1,80%) cao hơn rong thu tại Bãi Trù - Vinpearland (1,45%) so với trọng lượng rong khô đã được xử lý loại bỏ các hợp chất màu và lipid. Nguyên nhân dẫn đến sự khác nhau về hàm lượng thu nhận Fucoidan có thể là do ở mỗi khu vực sống khác nhau, điều kiện môi trường khác nhau dẫn đến quá trình sinh tổng hợp các hợp chất trong rong cũng khác nhau.
1 Bảng 3.2. Hàm lượng Fucoidan thu nhận từ 06 loài rong nâu Việt Nam[62,65] Stt Loài rong Hàm lượng Fucoidan % 1 S.swartzii 0,82 2 S.oligocystum 1,80 3 S.denticapum 2,00 4 S.mcclurei 2,37 5 S.polycystum 2,57 6 S.binderi 1,13
So với các kết quả về hàm lượng Fucoidan đã được cơng bố trước đó của các lồi rong sinh trưởng tại Việt Nam, trong cùng chi Sargasum như S.swartzii, S.oligocystum, S.denticapum, S.mcclurei, S.polycystum, S.binderi lần lượt là 0,82 %, 1,80 %, 2,00 %, 2,37 %, 2,57 %, 1,13 % có thể thấy hàm lượng Fucoidan trong cùng một chi rong lại khác nhau. Kết quả bảng 3.2 cho thấy hàm lượng thu nhận Fucoidan thô từ rong S. microcystum thấp hơn Fucoidan chiết từ các loài S.denticapum, S.mcclurei, S.polycystum và cao hơn một số rong S.binderi, S.swartzii trong cùng chi.
Bảng 3.3. Hàm lượng Fucoidan thu nhận từ 07 loài rong nâu thế giới
Stt Loài rong Nơi thu mẫu
Hàm lượng Fucoidan % TLTK 1 Sargassum stenophyllum Brazil 0,14 [73] 2 Sargassum ringgoldianum Brazil 0,13 [74] 3 Sargassum ringgoldianum Brazil 0,88 [75] 4 Sargassum fusiformis (Hizikia fusiformis) Nhật Bản 1,3 [76] 5 Sargassum myriocystum Nhật Bản 5,34 [77] 6 Sargassum wightii Ấn Độ 6,72 [78] 7 Sargassum horneri Mexico 4,3 [78]
So với các loài rong nâu thuộc chi Sargassum của các nước khác trên thế giới như Mexico, Brazil, Nhật Bản, Ấn Độ, Trung Quốc,… hàm lượng Fucoidan của rong nâu S. microcystum thu nhận tại Việt Nam cao hơn so với loài rong
1,30 % của Nhật Bản và thấp hơn các loài rong, Sargassum myriocystum 5,34 %,
Sargassum wightii 6,72% (Ấn Độ), Sargassum horneri 4,3 % (Mexico). Sự khác biệt về hàm lượng Fucoidan trong các lồi rong rất khó để đưa ra so sánh, bởi hàm lượng Fucoidan thu được nhìn chung thay đổi rất nhiều (0,1-20%) phụ thuộc vào điều kiện địa lý, quá trình sinh trưởng và phát triển, cũng như phương pháp chiết tách để thu nhận Fucoidan.
3.2. PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HĨA HỌC
3.2.1. Xây dựng đường chuẩn
Chúng tơi phân tích thành phần Fucoidan bao gồm : carbohydrate, sulfate và uronic acid bằng phương pháp truyền thống là xây dựng đường chuẩn và xác định mật độ quang của các chất cần phân tích. Kết quả xây dựng đường chuẩn các chất được dẫn ở phụ lục 1, phụ lục 2 và phụ lục 3.
Phân tích thành phần monosaccharide trong fuocidan bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), xây dựng đường chuẩn dựa trên diện tích peak tương ứng. Sử dụng điều kiện phân tích mẫu trên hệ thống sắc kí ion ICS – 6000 (Thermoscientific), sử dụng cột phân tích trao đổi anion CarboPac MA1(50mm x 4); đầu dị điện hóa (Electrochemical Detector – ED), pha động NaOH 1M, tốc độ dịng 0,4mL/ phút, thể tích tiêm mẫu 500 µL, thời gian phân tích là 30 phút, chúng tôi thu được sắc lý đồ trên hình 3.1 cho thấy các mẫu chuẩn bao gồm (Fucose, Arabinose, Glucose, Galactose) các peak có đỉnh nhọn hồn tồn tách biệt nhau.
đường chuẩn để xác định hàm lượng các thành phần monosaccharide theo các phụ lục 4,5,6,7.
3.2.2. Phân tích thành phần hóa học của Fucoidan
Để lựa chọn mẫu Fucoidan cho các nghiên cứu tiếp theo, chúng tơi tiến hành phân tích sơ bộ thành phần hóa học của 02 mẫu Fucoidan chiết từ loài rong
S.microcystum thu tại 02 địa điểm khác nhau.
2 Bảng 3.4. Hàm lượng thu nhận và thành phần hóa học Fucoidan từ hai khu vực
biển khác nhau Các kết quả
thu nhận
Nơi thu hái rong
Hòn Rùa Bãi Trù - Vinpearland
Hàm lượng carbohydrate tổng(%)(**) 36,06 24,4 Hàmlượng sulfate (%)(**) 19,16 25,54 Hàm lượng uronic axit(%)(**) 9,00 10,98
** Hàm lượng tính theo khối lượng mẫu Fucoidan thơ phân tích
Theo kết quả phân tích bảng 3.4 , mẫu Fucoidan thu nhận tại Hòn Rùa có hàm lượng carbohydrate cao hơn gần 1,5 lần so với mẫu rong thu hái tại Bãi Trù. Tuy nhiên hàm lượng sulfate của mẫu rong này lại thấp hơn so với mẫu Fucoidan được chiết tách với mẫu rong thu hái tại Bãi Trù. Sự khác biệt này rất đáng kể. Hàm lượng uronic axit của cả 2 mẫu Fucoidan cũng có sự khác nhau tuy nhiên không đáng kể. Theo các nghiên cứu của các nhà khoa học trước đây cho thấy sulfate và uronic axit là hai trong những yếu tố có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính sinh
pháp chiết Fucoidan bằng dung mơi axit lỗng cũng là phương pháp được lựa chọn trong nhiều nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính sinh học của Fucoidan đã được công bố.
Sau khi lựa chọn được Fucoidan chiết tách từ rong nâu S.microcystum thu
hái tại Bãi Trù, chúng tơi tiến hành phân tích thành phần polysaccharide , kết quả dẫn ra trên bảng 3.5.
Các kết quả phân tích trong bảng 3.5 cho thấy hàm lượng carbohydrate, sulfate và uronic axit của mẫu Fucoidan được chiết tách từ rong S.microc stum lần
l ợt tương ứng là 24,40 %; 25,54 % và 10,98%.
Kết quả bảng 3.5 cho thấy mẫu Fucoidan thô được thu nhận từ rong nâu
Sargassum microcystum trước khi chạy sắc kí phân đoạn ngồi ba thành phần
chính là fucose (36,10%) và galactose (22,40%), glucose (40,80%), cịn có thêm các đường đơn khác với hàm lượng rất nhỏ Arabinose (0,6%), không chứa N- Acetyl-galactosamine.
3 Bảng 3.5. Thành phần hóa học mẫu Fucoidan chiết từ rong S.microcystum
Kí hiệu mẫu
Thành phần đường đơn của Fucoidan (mol %) Cacbo hydrate % w/w** SO42- % w/w* * Uronic axit % w/w**
Fuc Gal Glu N-Acetyl
galactosamine Arabinose PS- S.micro cystum 36,10 22,04 40,80 nd 0,60 24,40 25,54 10,98
Fucoidan phân lập từ 6 loài cùng chi với S.microcystum rong nâu Việt Nam [67]. Tên loài HS (%) Thành phần đường trung bình (% mol) Gluc A (%) Sulfate (%)
Fuc Man Gal Xyl Glc
S. polycystum 2,70 32,4 2,7 36,3 11,1 10,2 6,8 25,7 S. mcclurei 2,10 40,0 2,1 33,1 6,2 20,6 5,2 26,5 S. oligocystum 1,60 37,6 1,6 37,0 10,7 7,1 6,5 24,9 S. denticarpum 2,20 42,1 2,2 38,9 15,9 2,0 5,8 25,2 S. swatzii 0,68 37,0 0,68 34,8 15,5 6,5 7,4 23,4 S.binderi 1,13 42,2 10,3 38,0 9,5 0
Các kết quả phân tích trong bảng 3.5 và 3.6 cho thấy mẫu Fucoidan thu nhận từ rong Sargassum microcystum do chúng tôi tiến hành khảo sát so với kết quả đã được công bố về Fucoidan của các loài rong trong cùng chi do tác giả Bùi Văn Nguyên, Phạm Đức Thịnh và các cộng sự [65,66,67] thu nhận chúng ta có thể nhận thấy, tỉ lệ giữa các gốc đường giữa các loài rong trong cùng chi khác nhau rất nhiều. Theo nhóm tác giả này, thành phần đường của mẫu Fucoidan được chiết tách từ các loài rong cùng chi Sargassum chứa chủ yếu đường fucose và galactose với tỉ lệ 1:1, gốc đường glucose chiếm 1 tỉ lệ rất nhỏ. Trong khi đó, thành phần đường đơn từ mẫu Fucoidan của lồi rong Sargassum microcystum tơi đã thu nhận và nghiên cứu ngồi hai thành phần chính đường Fucose (36,1%) và Galactose (22,4%) giống như các tác giả trước đó đã nghiên cứu với tỉ lệ 3:2 thì điểm khác
7,1%,S. denticarpum với hàm lượng glucose 2%,S. swatzii với hàm lượng glucozo 6,5%, S.binderi kh ng chứa glucose...) . Như vậy, hàm lượng các gốc đường này biến đổi theo từng thời điểm, vị trí địa lí thu rong, trong từng chi rong và từng loài rong khác nhau. Các kết quả này cũng hồn tồn phù hợp với các cơng bố trước đó về sự đa dạng của thành phần hóa học của Fucoidan. Kết quả phân tích thành phần đường chỉ ra rằng Fucoidan của các loài rong thuộc các chi rong khác nhau là khác nhau, các loài rong thuộc cùng một chi rong hay trong cùng một loài rong cũng khác nhau về thành phần và tỉ lệ mol giữa các gốc đường đơn. Những đặc điểm này tạo ra sự đa dạng cấu trúc cũng như hoạt tính sinh học của Fucoidan, nhưng đồng thời cũng làm cho việc phân tích chi tiết cấu trúc của Fucoidan trở nên vơ cùng phức tạp. Đó chính là lý do tại sao cho đến nay trên thế giới mới chỉ có một vài công bố về cấu trúc hồn chỉnh của Fucoidan, nhưng khơng một công bố nào đưa ra được mối liên hệ có tính quy luật cho cấu trúc Fucoidan với các bộ rong.
Sự khác nhau này có thể được giải thích do sự khác nhau về vị trí và thời gian thu mẫu. Điều này cho thấy thành phần cũng như đặc điểm cấu trúc của Fucoidan vô cùng phức tạp.
Theo các cơng bố [63,64,65,66,67] thì các Fucoidan của các loài rong tại các vùng biển Việt Nam đều có một đặc điểm chung là bên cạnh hàm lượng sulfate cao, hai gốc đường fucose và galactose luôn chiếm hàm lượng lớn hơn so với các gốc đường khác, với đặc điểm này chúng được gọi là các galactofucan sulfate hóa.
So với Fucoidan chiết từ các lồi rong nâu khác trên thế giới như Nga, Nhật Bản, Hàn Quốc,... thì Fucoidan chiết từ rong nâu Việt Nam có sự khác biệt lớn về thành phần các đường đơn. Đó là hàm lượng fucose thấp hơn. Fucoidan phân lập từ một số lồi rong nâu của vùng Viễn Đơng, L.B.Nga có hàm lượng fucose cao hơn rất nhiều như Fucoidan chiết tách từ rong Fucus evanescens, Laminaria japonica
và Laminaria cichorioides có hàm lượng fucose (tính theo carbohydrate) lần lượt là 88%, 86% và 100% [37,53], hay Fucoidan chiết từ rong Hizikia fusiformis
(Nhật Bản) hàm lượng fucose chiếm 80%, Fucoidan của từ rong Sargassum stenophyllum (Brazil) hàm lượng fucose chiếm 67,8%, hiện nay loại Fucoidan duy
Fucus vesiculosus có hàm lượng fucose chiếm 100%. Điều này cho thấy sự đa dạng về thành phần hóa học của Fucoidan trong các lồi rong khác nhau, thậm chí là trong cùng một chi rong Sargassum của Việt Nam và của Brazil cũng có thành phần rất khác nhau. Nhìn chung Fucoidan của rong nâu sinh trưởng ở vùng biển ơn đới thường có thành phần đường tương đối đơn giản, chúng hầu như chỉ có một gốc đường fucose và một lượng rất nhỏ các đường đơn khác. Trong khi đó Fucoidan của rong nâu ở biển nhiệt đới nói chung và biển Việt Nam nói riêng phần lớn thuộc nhóm galactofucan, trong thành phần chủ yếu chứa hai gốc đường fucose và galactose cùng với một lượng nhỏ các gốc đường khác như rhamnose, xylose, mannose, glucose. Sự khác nhau về thành phần và hàm lượng các đường đơn của Fucoidan từ các loài rong khác nhau một lần nữa khẳng định rằng điều kiện mơi trường có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh tổng hợp polysaccharide của rong nâu.
3.2.3. Tách phân đoạn và thành phần hóa học các phân đoạn Fucoidan
Fucoidan là polymer tự nhiên có cấu trúc phức tạp mà trong thành phần hóa